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    原位杂交实验流程

    发布时间: 2024-04-23  点击次数: 191次

    原位杂交组织(或细胞)化学简称原位杂交,属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。


    一、合成RNA探针

    1、设计探针引物

    RNA探针长度500bp最为合适。一轮引物不添加启动子序列,二轮引物在正向引物的5端加上T7启动子序列,在反向引物的5端加上SP6启动子序列。


    2、探针合成

    用未添加启动子序列的引物克隆出探针序列的DNA模板,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。胶回收,将其连接到T载体上,转化涂板,进行质粒提取送测。用添加了T7和SP6启动子序列的引物再次给探针序列两端添加上启动子序列。取一轮以质粒为模板扩增PCR产物进行琼脂糖进行PCR扩增,凝胶电泳验证,若条带单一明亮,胶回收PCR产物用于后续体外转录。


    3、体外转录

    利用PCR扩增出的带有启动子序列探针的DNA模板,分别用相应的RNA聚合酶进行体外转录,得到单链RNA探针。探针包括正义探针和反义探针,用正义探针(T7RNA 聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验作为阴性对照组,用反义探针(SP6RNA聚合酶转录得到)进行的原位杂交实验为实验组。体外转录体系如下:

    组分名称

    体系

    探针模板

    600ng-1μg

    Transcription Buffer (10×)

    2μl

    RNA Polymerase T7

    2μl

    NTP labeling mixture (10×)

    2μl

    RNase Inhibitor (40U/μl)

    1μl

    RNase-free H2O

    补至20μl

    混匀后37,孵育2小时。

    4.质量检测、中止消化

    转录结束后,取1ul转录产物进行琼脂糖凝胶电泳验证,电泳条带明亮不弥散则进行下一步。验证后,每管加入2DNase,37消化15min,去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)终止消化反应。


    5.沉降洗涤保存

    每管用DEPC水补至100uL,加入2倍体积的的无水乙醇和1/10体积的的3M乙酸钠,置于-80℃沉降过夜/-20℃沉降30分钟。将沉降后的体系放入离心机中,4℃,12000rpm离心15分钟,弃除上清。加入100uL70%无水乙醇浸洗,4℃,12000rpm离心15分钟,弃除上清,在超净台风干。将沉淀的RNA探针加入DEPC水溶解,使其浓度为10ng/uL,分装后放入-80℃保存备用。


    注意事项:

    (1)DEPC 即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可灭活各种蛋白质,是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在各步处理中,所有液体试剂都应经 DEPC 处理。


    (2)含有 Tris缓冲液的溶液中,不能加入 DEPC。


    (3)原位杂交引物用同一个遗传背景的个体克隆全长测序成功,在测序成功的全长序列上设计引物,保证特异性。


    二、杂交

    1、准备工作

    ①圆形细胞爬片在浓盐酸中浸泡过夜,经超纯水冲洗后,浸泡在无水乙醇中;②将圆形细胞爬片、玻璃培养皿、金属镊子180℃高温烘4h去除RNase;③取出后静置1h冷却,培养皿中加入0.1mg/ml多聚赖氨酸处理。④正、反面各避光浸泡15min;⑤ 用镊子依次夹取玻片,迅速蘸取DEPC水,正面朝上放在锡箔纸折起的褶皱上,37℃放置3h备用。


    2、组织包埋与切片

    原位杂交实验组织石蜡包埋,将包埋好的蜡块从-20℃取出,刀片、台面、切片机等用RNase抑制剂喷雾喷洒擦净,修整好的蜡块固定于切片机上,切片厚度设置为5μm,将蜡带在43℃ DEPC水中水浴展开,用多聚赖氨酸处理过的圆形玻片捞取蜡带,置于锡箔纸褶皱上37℃烘干过夜。


    3、脱蜡与复水

    镊子夹取圆形玻片依次于下述玻璃培养皿中:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脱蜡→二甲苯:乙醇(1:1) 6min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度复水。


    4、预杂交

    ①镊子夹取圆形玻片至24孔板中,每孔加入500μl DEPC水洗涤4min;②加500μl PBST(1×PBS+0.1%Tween-20)洗涤10min,洗2次;③加300μl 2μg/ml蛋白酶K,37℃消化12min;④加500μl 0.1M TEA孵育10min;⑤加500μl PBST 10min,洗涤两次;⑥加500μl 4%的多聚甲醛,避光固定20min;⑦加500μl PBST,10min,洗涤两次;⑧加300μl HB杂交液,60℃预杂交4h。

    HB杂交液的配制:

    组分名称

    体系

    去离子甲酰    

    10ml      

    20×SSC      

    5ml

    BR              

    4ml

    酵母tRNA(5μg/ml)  

    400μl

    DEPC H2O      

    400μl

    0.1%Tween-20      

    200μl

    HB现用现配,本次实验一次配制3份。

    5、探针变性与杂交

    将200ng探针加入到30μl HB杂交液中,95℃变性5 min,迅速置于冰上冷却,然后加入到270μl已60℃预热的装有HB杂交液中1.5ml 无酶管中,充分混匀后加入到样品孔中,60℃杂交17h。

    6、洗脱探针

    洗脱探针所用试剂均需37℃/60℃预热,并在相应环境中洗脱。

    洗脱探针条件

    洗脱液

    温度

    洗涤时间

    洗涤次数

    2×SSC      

    60℃

    20min

    2

    2×SSC              

    37℃

    10min

    2

    2×SSC      

    60℃

    20min

    1

    1×SSC                  

    60℃

    20min

    1

    0.2×SSC+ 0.1%tween20

    60℃

    20min

    1

    7、封闭、抗体孵育

    ①向样品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗涤10min,洗涤两次。②加入300μl Blocking bufferr(1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20)避光封闭1.5h。③按照1:3000比例将Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗体加入到Blocking buffer中,充分混匀后吸取 300μl 加入样品孔,避光孵育 1h。

    8、洗涤抗体

    向样品孔加入500μl MaNaT洗涤抗体,避光洗涤5min重复2遍,再加入500μl MaNaT洗涤抗体,避光洗涤15min重复4遍。

    9、显色及终止反应

    吸出 MaNaT,加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗涤两次,每次5min;按1:50的比例将 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中,充分混匀后吸取 400μl 加入样品孔,避光显色10min,镜检观察到蓝紫色信号时,吸出显色液。

    10、复染

    吸出 PBST,加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min;吸出固定液,加入 500μl PBST 洗涤两次,每次 10 min;吸出 PBST,加入 300μl 1%中性红染液复染。

    11、封片

    复染后,用镊子夹取玻片,依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脱水;在 100%无水乙醇:二甲苯(1:1)中处理浸泡2min;在二甲苯中浸泡5 min;最终以中性树胶封片。

    12、显微观察

    使用 1 至 4 倍放大倍数观察组织杂交整体信号表达情况,使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍数观察局部杂交信号,拍照。

    原位杂交实验流程

    A, B:斑马鱼中某基因正义RNA探针信号分布;

    C, D: 斑马鱼中某基因反义RNA探针信号分布。

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