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    细胞计数的实验步骤&问题分析

    发布时间: 2024-04-25  点击次数: 153次

    细胞计数在细胞实验中是非常常见的,大多数实验室目前使用细胞计数板进行细胞计数,细胞计数板的结构如下图所示:

    细胞计数的实验步骤&问题分析

    实验步骤

    1.所用细胞密度达到一定要求后进行细胞计数铺板,提前准备好细胞计数板、盖玻片、计数器;

    2.弃掉原有培养基,加入1ml温浴的PBS缓冲液清洗;

    3.弃掉PBS缓冲液,加入胰酶消化细胞,消化时间根据细胞类型及日常经验决定;

    4.消化相应时间后,加入二倍体积的培养基终止消化,用移液器将细胞全部吹下,转移至离心管内;

    5.离心机室温800rpm,离心5min;

    6.准备和所计数细胞种类相同的1.5ml Ep管,各加入PBS缓冲液980ul备用;

    7.准备细胞计数板,并在计数区盖上盖玻片;

    8.将5中离心结束的细胞弃上清,加入1ml培养基,充分混悬后取20ul加入到6中的Ep管中,充分颠倒混匀后取12ul加入牛鲍计数板一侧的计数区内,保证计数区充盈。

    9.低倍显微镜(物镜4)下找到计数视野,上图中“"B C D E“"区为细胞计数区。

    10.高倍镜(物镜10)下计数细胞,依次计数4个方格内的细胞数量。

    11.计算细胞数量,假设4个方格内细胞总数为A,则每ml的细胞数量为:A/4×104×50(稀释倍数)=B个。

    12.假设铺板所需细胞密度为1×104个/ml,则所需8中的细胞混悬液的量为:1×104×C(培养基所需毫升数,如6孔板每孔加培养基2ml)/B=D ml,最后换算成μl即可。

    13.铺板:取C ml培养基,加入8中细胞混悬液D μl,充分混匀后依次加入培养皿中,放入细胞培养箱内即可。

    细胞计数的实验步骤&问题分析

    常见问题及注意事项
    1.镜下计数细胞时,压线细胞按照“计上不计下,计左不计右"的原则进行,若有少量成团细胞,则按1个细胞处理,若成团细胞太多,说明在步骤8中,细胞不全部混悬,未能所有都分开成单细胞,因此需重新进行上述步骤。
    2.需要铺板的细胞长满时数量较多,因此计数时稀释倍数尽量大,取混悬液的每一步保证细胞充分混匀,计数结果更为准确。
    3.镜下计数细胞时,最少计数两次,取平均值为最终结果。

    4.细胞混悬液加入细胞计数板时,建议使用10μl小枪头、2-20μl移液器,枪头倾斜抵住盖玻片边缘,缓慢加入,务必保证细胞混悬液全部加入,计数区充盈。

    关于细胞计数,以如下实例来充分理解上述计算过程:

    1.假设实验要求最后铺板密度为1×105个/ml,计划以6孔板铺板,拟使用4个孔,每孔2ml培养基,则所需细胞总数为:1×105×2ml×5孔=1×106个。
    2.假设4孔细胞总数为100个,则细胞密度为:100/4×104×50(稀释倍数)=1.25×107个/ml。
    3.最终所需细胞悬液量为:1×106/1.25×107=0.08ml=800μl

    4.铺板:培养基5孔(为防止不够所以多准备1孔)2ml×5孔=10ml加入细胞混悬液800μl,混匀加入六孔板即可。

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