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    悬浮细胞的瞬时转染操作

    发布时间: 2024-04-29  点击次数: 95次

    细胞转染前的准备:

    悬浮细胞的瞬时转染操作

    1.细胞:

    贴壁生长细胞:一般要求在转染前一日,必须用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,转染当日的细胞密度以70%-90%(贴壁细胞),最好在转染前2-4h换一次新鲜培养液。


    悬浮细胞:转染前12-16h进行悬浮细胞传代,传代后适宜的细胞密度为20-40x104/mL。台盼蓝染色进行活细胞计数保持活细胞比在95%以上。


    提前将293F细胞的密度调整至合适的密度后(2×106 - 4×106细胞/ml)于37°C摇床培养2-4h后进行转染。注意,参与转染的细胞必须是培养三代或以上的稳定细胞株。


    2.DNA:使用去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒,于生物安全柜/超净台用0.22um滤头过滤除菌。


    3.稀释液:于生物安全柜/超净台用0.22 μm滤头过滤除菌。


    4、转染试剂:转染试剂如PEI溶液长期储存于- 20℃,不可反复冻融,溶液在4℃放置不超过一周。


    操作步骤(悬浮细胞):

    1、取一支已灭菌的Ep管,加入一定量的DNA,以相应体积的300 mM NaCl稀释,用枪头混匀后静置5 min;

    另取一支已灭菌的Ep管,加入相应体积的300 mM NaCl稀释对应体积的PEI溶液用枪头混匀后静置5 min(稀释液与DNA、PEI的总体积应为转染体积的5%)。

    将质粒和PEI溶液混合,枪头混匀后静置一段时间,使DNA与PEI形成稳定的聚合物。

    2、从摇床中取出293F细胞。用1 mL移液枪滴缓慢滴加转染混合液,边加边摇晃摇瓶使转染更加充分。

    3、转染后将悬浮细胞置于摇床中培养,条件为37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h进行细胞计数并用台盼蓝染色液观察细胞的存活率。

    注意事项:

    1、DNA纯度:使用去内毒素的质粒大提试剂盒,细菌产生的内毒素对细胞状态有很大的影响。

    用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其他化学物质的污染,确保质粒OD值A260/A280在1.8~2.0之间。

    提完质粒后进行琼脂糖凝胶电泳实验验证DNA的纯度,通常情况下DNA为超螺旋状态(此状态下转染效率更高)。

    2、优化条件

    质粒不同,所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下转染效率低,蛋白表达量低,基于这种情况需要对质粒转染试剂的配比、DNA的浓度、质粒与转染试剂的聚合时间进行优化。

    3、转染的稀释液

    研究报道,300 mM NaCl溶液稀释DNA和转染试剂转染效率比普通培养基高。

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