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    CRISPR-Cas9系统:慢病毒转染

    发布时间: 2024-04-29  点击次数: 227次

    CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术,旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。


    实验步骤:

    1.质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带

    sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标。


    2.慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质粒,其中包括pCMV-VSV-G(携带包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(携带包装蛋白)。这两者协同作用,使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-Cas9系统到目标细胞内。


    3.细胞培养:使用适宜的培养基培养目标细胞,通常选择293T细胞,以确保细胞处于最佳的生长状态。


    4.转染试剂准备:在进行转染前,将培养基更换为适用于阳离子脂质体转染的Opti-MEM减血清培养基。同时,准备转染试剂,包括Lipofectamine 3000、助转剂P3000以及含有CRISPR-Cas9系统的质粒。

    CRISPR-Cas9系统:慢病毒转染

    5.转染操作:将质粒混合物与转染试剂按照试剂盒的推荐比例进行混合,随后滴加到目标细胞上,此过程中,确保混合物与细胞充分接触,有利于转染效率的提高。


    6.培养条件:将细胞置于37°C、5%CO2的培养箱中,培养一定的时间,通常在48小时内。


    7.收获:收集细胞上清液,通过离心去除细胞残渣。


    8.滤膜过滤:使用0.22 μm孔径的聚醚砜滤膜过滤细胞上清液,以去除残留的细胞碎片和其他杂质。


    9.慢病毒收获:得到的慢病毒上清液即为经过纯化和感染活性验证的慢病毒,可用于后续实验中对目标细胞进行感染(若病毒感染效率低,可使用试剂盒进行浓缩病毒)。


    10.慢病毒感染:将目的细胞接种于 6孔板中,待细胞贴壁后进行慢病毒感染,感染后48H,加入适量浓度的筛选药物puromycin(具体浓度通过药物筛选实验获得),24h后换液去除死细胞,继续传代维持培养。


    11.单克隆筛选:

    ①流式细胞术筛选:此法存在一些不足之处,其中包括重悬细胞后进行流式筛选的过程。因为这种操作可能导致细胞经历多次振荡,增加了细胞的脆弱性,细胞的生存状况可能会受到不良影响,所以不太建议采用这种方式。


    ②无限稀释法,将96个细胞稀释至10ml培养基中,然后将其种植到96孔板中,确保每个孔内只有一个细胞。完成种植后,建议在观察过程中每次仅观察十个孔,因为长时间的外部观察可能导致细胞受到应激损伤,影响后续的细胞培养,甚至会导致部分细胞死亡。进行单克隆细胞培养时,首先将细胞铺在96孔板中,培养至细胞长至80%的融合后进行消化。随后,将细胞传到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中,以确保单克隆的纯化。并非所有细胞都能成功生长,因此在考虑实际情况时,一般需要大约一两个月的时间才能获得理想的实验结果。


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