CRISPR-Cas9系统：慢病毒转染

CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术，旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。

实验步骤：

1.质粒构建：构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带

sgRNA序列，可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标。

2.慢病毒包装质粒：准备慢病毒包装质粒，其中包括pCMV-VSV-G（携带包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（携带包装蛋白）。这两者协同作用，使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-Cas9系统到目标细胞内。

3.细胞培养：使用适宜的培养基培养目标细胞，通常选择293T细胞，以确保细胞处于最佳的生长状态。

4.转染试剂准备：在进行转染前，将培养基更换为适用于阳离子脂质体转染的Opti-MEM减血清培养基。同时，准备转染试剂，包括Lipofectamine 3000、助转剂P3000以及含有CRISPR-Cas9系统的质粒。

5.转染操作：将质粒混合物与转染试剂按照试剂盒的推荐比例进行混合，随后滴加到目标细胞上，此过程中，确保混合物与细胞充分接触，有利于转染效率的提高。

6.培养条件：将细胞置于37°C、5%CO2的培养箱中，培养一定的时间，通常在48小时内。

7.收获：收集细胞上清液，通过离心去除细胞残渣。

8.滤膜过滤：使用0.22 μm孔径的聚醚砜滤膜过滤细胞上清液，以去除残留的细胞碎片和其他杂质。

9.慢病毒收获：得到的慢病毒上清液即为经过纯化和感染活性验证的慢病毒，可用于后续实验中对目标细胞进行感染（若病毒感染效率低，可使用试剂盒进行浓缩病毒）。

10.慢病毒感染：将目的细胞接种于 6孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后48H，加入适量浓度的筛选药物puromycin（具体浓度通过药物筛选实验获得），24h后换液去除死细胞，继续传代维持培养。

11.单克隆筛选：

①流式细胞术筛选：此法存在一些不足之处，其中包括重悬细胞后进行流式筛选的过程。因为这种操作可能导致细胞经历多次振荡，增加了细胞的脆弱性，细胞的生存状况可能会受到不良影响，所以不太建议采用这种方式。

②无限稀释法，将96个细胞稀释至10ml培养基中，然后将其种植到96孔板中，确保每个孔内只有一个细胞。完成种植后，建议在观察过程中每次仅观察十个孔，因为长时间的外部观察可能导致细胞受到应激损伤，影响后续的细胞培养，甚至会导致部分细胞死亡。进行单克隆细胞培养时，首先将细胞铺在96孔板中，培养至细胞长至80%的融合后进行消化。随后，将细胞传到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中，以确保单克隆的纯化。并非所有细胞都能成功生长，因此在考虑实际情况时，一般需要大约一两个月的时间才能获得理想的实验结果。

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