石蜡切片HE染色实验

苏木精-伊红染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining )，简称HE染色法，切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使用细胞核内的染色质与胞质内的核糖着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

实验步骤：

1.取样固定

取新鲜的组织样品，加入4%多聚甲醛组织固定液的EP管中。取样材料应该小而薄，约黄豆粒大小。

2.脱水

采用梯度酒精浓度法脱水。通常选择50%-60%-70%-90%-95%-100%的浓度梯度，各酒精浓度要求准确，95%以前各步骤脱水1h，95%和100%均分为两步进行，分别脱水30min，实验中常将组织在后一步的95%的酒精溶液中过夜，以便进行脱脂。

3.透明浸蜡

为了使石蜡更容易进入组织，要对脱水后的组织进行透明处理，二甲苯：无水乙醇（1:1）溶液和二甲苯透明样品各30ml，在60°C的石蜡溶液中充分浸泡2h。

4.包埋和切片

通过包埋机，将浸泡后的组织块使用蜡液包埋后，放到冷台上凝固，之后使用刀片进行修整，在切片机上固定好后进行连续切片（5um），所得的切片用银子在42°C温水中展开，之后固定在载玻片上，经40°C烘干后进行HE染色。

5.HE染色

HE染色的程序是将切片浸入二甲苯ⅠⅡ，95%酒精，90%酒精,80%酒精,70%酒工各15min.二甲苯:100%酒精(1 :1),100%酒精Ⅰ,50%酒精,蒸馏水各2 min,苏木精染液5~10 min,水洗后分化入1%盐酸酒精5 s,自来水10min,1%氨水蓝化,自来水,50%,70%,80%,90%和95%酒精各2 min,伊红染液5 min,95%酒精,100%酒精ⅠⅡ,100%酒精:二甲苯(1: 1),二甲苯I、各2 min。中性树脂封片，不应该等切片上的二甲苯干了再封固。

注意事项：

染色过程需要优化，染色状况与组织或细胞的种类有关，也随着生活周期及病理变化而改变；

①固定时要注意组织在固定液中的位置,并且随时翻动组织,使其充分固定。

②若组织脱水不净时，则会造成随后的透明和浸蜡过程中二甲苯和石蜡液无法渗入组织,所以应该保证脱水液体的浓度,并经常更换新溶液。

③透明：一般30分钟就可达到透明的程度，但温度较低时可适当延长时间或置于温箱中加热。

④浸蜡、包埋：浸蜡和包埋要尽量在恒温下操作，防止中间出现温度差，蜡的温度要适宜，蜡块中不能出现气泡、裂隙‚斑点‚对于碎小组织要尽可能使其处于同一平面，否则会造成切片不全与漏切。

⑤切片：在夏季切片时，为保持蜡块硬度，可把蜡块放于冰柜中切时取出组织蜡块四周在切片前应修齐大小适当。不宜过重过猛，容易造成切片厚薄不均，甚至毁坏蜡块。

⑥染色：染色前切片脱蜡要透彻。染色时间要根据染液的新旧适当调整，必要时在染色过程中用显微镜观察，染色过程中避免阳光照射。染色过程中水冲洗不宜太猛。

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