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    细胞稳定转染的操作步骤及经验分享

    发布时间: 2024-06-12  点击次数: 153次

    细胞稳定转染是一种常用的基因传递技术,其中慢病毒转染作为一种有效的手段被广泛采用。通过慢病毒载体,可将目的基因序列稳定地整合到宿主细胞基因中,实现长期稳定的表达。这种转染方法不仅能够在多种细胞系中高效地实现基因传递,还能够实现对特定基因的稳定表达,为基因功能研究和细胞工程提供了重要工具。


    早在1981年,科学家们发现并研究了人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1),从而掀开了慢病毒作为载体的研究序幕。慢病毒(Lentivirus)载体是通过HIV-1进行改造而得到的,其具备感染细胞的能力,包括分裂期和非分裂期细胞,同时在宿主体内能够实现长期表达且具备较高的安全性。这种载体能够稳定表达外源基因,具有广泛的感染范围等优势,因此在基因过表达、RNA干扰、miRNA研究等实验中得到广泛应用。


    一、实验步骤

    1、提前一天准备细胞

    在进行转染前一天,首先对293T细胞进行胰酶消化处理,并将其培养于10厘米培养皿中,以确保细胞能够充分贴壁且密度达70%-80%。随后,将细胞置于37摄氏度、含有5% CO2的培养箱中孵育8至24小时,待细胞全部贴壁后即可开始进行转染操作。


    2、转染

    1)转染前,需换液,使用10毫升血清培养基替换旧的培养基。


    2)制备混合物包括包装质粒和目的质粒与转染试剂;

    a. 将8µg 目的质粒和16µg 病毒包装质粒(psPAX2:pMD2.G=1:1)加入到1ml 无血清Opti-DMEM,充分混合;


    b. 将50µl转染试剂溶于1ml Opti-DMEM中,充分混合,静置5分钟;


    c. 将转染试剂稀释液滴加入质粒稀释液中,边滴加边轻轻混合,然后在室温下静置20分钟,使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。取出培养皿,将配制好的DNA-转染试剂混合物加入培养皿中,轻轻混合,标记后放回培养箱中;


    3)经过6~8小时后,吸除培养基,用4ml PBS清洗一次,然后加入8ml 新鲜血清培养基进行培养。


    3、收病毒

    进行转染后,每隔24小时将培养上清收集至50毫升离心管中,进行适当标记,并为细胞更换新鲜的血清培养基。在最后一次收集病毒液后,应将接触过病毒的枪头、离心管、培养皿等物品浸泡于84消毒液中进行消毒处理,然后安全丢弃。

    细胞稳定转染的操作步骤及经验分享

    4、包装病毒

    贴壁细胞:

    1)慢病毒转染前一天,将贴壁细胞铺到24孔板中,确保每孔约有2×10^5个细胞。第二天,在37摄氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鲜培养基替换原有培养基,并加入适量病毒悬液孵育。

    2)对于polybrene毒性敏感的细胞,在转染后4小时内加入2毫升新鲜培养基以稀释polybrene。

    3)继续培养24小时,然后用新鲜培养基替换含病毒的培养基。

    4)继续传代培养,如果慢病毒含有荧光蛋白,在转染后48小时通常可观察到明显的荧光表达,72小时后表达更为明显,如果慢病毒含有抗性基因并需要进行药物筛选,则可在转染3-4天后开始添加药物。

    悬浮细胞:

    1)将浓度为6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml悬浮细胞中,并加入适量病毒,充分混匀后在37摄氏度下孵育。或者进行室温离心,离心速度为150g,持续4小时(对于难以转染的细胞系,可选择此步骤以提高转染效率)。

    2)对于对polybrene毒性敏感的细胞,转染后4小时,加入相同体积的新鲜培养基以稀释polybrene。

    3)继续培养3-4天。根据细胞生长情况,可以进行细胞传代或者更换培养基

    二、注意事项

    1)进行慢病毒相关实验时要注意安全,穿实验服,戴口罩和手套。

    2)在操作病毒时务必小心,避免产生气雾或飞溅,所有接触过病毒的工具,如枪头、离心管、培养皿以及培养液,请浸泡在84消毒液中过夜后,确保全部消毒后再进行处理。

    3)病毒操作时要使用生物安全柜,如果使用普通超净工作台,不能打开风机。

    4)如果加入Puromycin后观察到细胞死亡较多,务必及时更换培养基,以防止死细胞释放的有害物质影响到具有抗性的细胞的生长。

    5)需注意病毒液的储存方式:若在短时间内(3天内)需要使用,可将病毒液存放于4摄氏度的冰箱中。然而,若无法在短期内全部使用,建议将慢病毒液分装后置于-80摄氏度的冰箱中保存。在分装时应根据每次使用的量进行,将准确的病毒液分装至冻存管中,并做好日期和储存量的标记,封口膜密封以确保密封性。病毒液在-80摄氏度的冰箱中可保存约6个月。

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