细胞稳定转染的操作步骤及经验分享

细胞稳定转染是一种常用的基因传递技术，其中慢病毒转染作为一种有效的手段被广泛采用。通过慢病毒载体，可将目的基因序列稳定地整合到宿主细胞基因中，实现长期稳定的表达。这种转染方法不仅能够在多种细胞系中高效地实现基因传递，还能够实现对特定基因的稳定表达，为基因功能研究和细胞工程提供了重要工具。

早在1981年，科学家们发现并研究了人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1），从而掀开了慢病毒作为载体的研究序幕。慢病毒（Lentivirus）载体是通过HIV-1进行改造而得到的，其具备感染细胞的能力，包括分裂期和非分裂期细胞，同时在宿主体内能够实现长期表达且具备较高的安全性。这种载体能够稳定表达外源基因，具有广泛的感染范围等优势，因此在基因过表达、RNA干扰、miRNA研究等实验中得到广泛应用。

一、实验步骤

1、提前一天准备细胞

在进行转染前一天，首先对293T细胞进行胰酶消化处理，并将其培养于10厘米培养皿中，以确保细胞能够充分贴壁且密度达70%-80%。随后，将细胞置于37摄氏度、含有5% CO2的培养箱中孵育8至24小时，待细胞全部贴壁后即可开始进行转染操作。

2、转染

1）转染前，需换液，使用10毫升血清培养基替换旧的培养基。

2）制备混合物包括包装质粒和目的质粒与转染试剂；

a. 将8µg 目的质粒和16µg 病毒包装质粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 无血清Opti-DMEM，充分混合；

b. 将50µl转染试剂溶于1ml Opti-DMEM中，充分混合，静置5分钟；

c. 将转染试剂稀释液滴加入质粒稀释液中，边滴加边轻轻混合，然后在室温下静置20分钟，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。取出培养皿，将配制好的DNA-转染试剂混合物加入培养皿中，轻轻混合，标记后放回培养箱中；

3）经过6~8小时后，吸除培养基，用4ml PBS清洗一次，然后加入8ml 新鲜血清培养基进行培养。

3、收病毒

进行转染后，每隔24小时将培养上清收集至50毫升离心管中，进行适当标记，并为细胞更换新鲜的血清培养基。在最后一次收集病毒液后，应将接触过病毒的枪头、离心管、培养皿等物品浸泡于84消毒液中进行消毒处理，然后安全丢弃。

4、包装病毒

贴壁细胞：

1）慢病毒转染前一天，将贴壁细胞铺到24孔板中，确保每孔约有2×10^5个细胞。第二天，在37摄氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鲜培养基替换原有培养基，并加入适量病毒悬液孵育。

2）对于polybrene毒性敏感的细胞，在转染后4小时内加入2毫升新鲜培养基以稀释polybrene。

3）继续培养24小时，然后用新鲜培养基替换含病毒的培养基。

4）继续传代培养，如果慢病毒含有荧光蛋白，在转染后48小时通常可观察到明显的荧光表达，72小时后表达更为明显，如果慢病毒含有抗性基因并需要进行药物筛选，则可在转染3-4天后开始添加药物。

悬浮细胞：

1）将浓度为6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml悬浮细胞中，并加入适量病毒，充分混匀后在37摄氏度下孵育。或者进行室温离心，离心速度为150g，持续4小时（对于难以转染的细胞系，可选择此步骤以提高转染效率）。

2）对于对polybrene毒性敏感的细胞，转染后4小时，加入相同体积的新鲜培养基以稀释polybrene。

3）继续培养3-4天。根据细胞生长情况，可以进行细胞传代或者更换培养基

二、注意事项

1）进行慢病毒相关实验时要注意安全，穿实验服，戴口罩和手套。

2）在操作病毒时务必小心，避免产生气雾或飞溅，所有接触过病毒的工具，如枪头、离心管、培养皿以及培养液，请浸泡在84消毒液中过夜后，确保全部消毒后再进行处理。

3）病毒操作时要使用生物安全柜，如果使用普通超净工作台，不能打开风机。

4）如果加入Puromycin后观察到细胞死亡较多，务必及时更换培养基，以防止死细胞释放的有害物质影响到具有抗性的细胞的生长。

5）需注意病毒液的储存方式：若在短时间内（3天内）需要使用，可将病毒液存放于4摄氏度的冰箱中。然而，若无法在短期内全部使用，建议将慢病毒液分装后置于-80摄氏度的冰箱中保存。在分装时应根据每次使用的量进行，将准确的病毒液分装至冻存管中，并做好日期和储存量的标记，封口膜密封以确保密封性。病毒液在-80摄氏度的冰箱中可保存约6个月。

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