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    提高效率与质量的实用技巧

    发布时间: 2024-06-12  点击次数: 140次

    1、提高实验的效率

    1)实验前有计划安排、预备方案或者“车轮战"(细胞实验)

    一般从基础的培养细胞开始,开始实验时,实验方法一般来自于实验室或者文献中条件优化以及自我推测及验证,因此做实验之前预想实验方案有助于我们不至于“手忙脚乱"。


    以实验前的细胞铺板实验为例:

    表1 常用细胞培养体系:

    提高效率与质量的实用技巧

    细胞铺板的孔数一般取决于我们后期实验的目的,实验前了解各类细胞的铺板数量以及培养基添加量都十分重要。以病毒或者细菌感染细胞模型来说,我们需要一个比较准确数量级的细胞数目和病毒或菌液浓度得后期实验的MOI值,细胞计数和病毒及菌液浓度测定也很关键;


    细胞铺板:我们需要收集尽可能多的细胞,原因是当我们剩余出来的细胞可用于细胞传代继续保留,可若是铺板数量达不到(重新离心收集细胞浪费时间)可能会导致加药浓度过大使得细胞大量死亡而影响后期实验,比如你要提取RNA或者蛋白,细胞数目不足,后期的RNA浓度或者BCA测蛋白浓度的结果都不是非常理想继而影响后面实验的进展。


    2)具体安排(Western blot实验)

    从试验干扰开始(给药处理),根据实验步骤来讲,完整的Western blot实验预计2-3天。

    (1)以给药时间24h为例:24h后,收集细胞提取蛋白,贴壁细胞加IP裂解液或RIPA裂解液用细胞刮板移至1.5ml离心管;悬浮细胞收集细胞至离心管离心去除培养基,用PBS清洗离心去除上清再加入裂解液,预计提取蛋白以及BCA测蛋白浓度一上午的时间,估计上样体积加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存;下午跑蛋白电泳,SDS-PAGE胶可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存(用少量纯水用封装袋保存)或使用预制胶,大概1多小时蛋白maker跑到距离胶最下面1-2cm处停止电泳;转模,根据目的蛋白的大小确定转膜时间和毫安数,结束后裁膜用5%脱脂奶粉封闭,之后孵育一抗4℃过夜,第二天洗膜孵育二抗并进行显影,因此步骤时间熟练的话2天就可以完成一次WB实验。

    (2)预备方案:实验重复是不可避免的,因此预备下一周期实验方案(车轮战)有助于缩短时间提高效率,当然,师兄师姐以及广大学术里的经验小tips也有助于提高实验效率。例如,在WB配制SDS-PAGE胶的凝固时间通常会随季节温度的变化而改变,夏季和冬季应该时间就会产生差异(冬季凝固较慢),再者,AP 和TEMED 作为促凝剂,一般都是最后加入,尤其是AP(过硫酸铵)。实验之前我们可能都会设计一个预期结果,我们可以在上一周期实验的空余时间预备下一周所需要的实验条件,例如重新细胞铺板给药等待时间周期等等。

    2、提高实验结果的质量:减小系统误差,消除人为错误

    以qPCR为例:该实验检测基因的mRNA表达水平,操作过程要求一定的准确性,因为加样体系较小,各试剂的加样量更要求精准,下面是一些来自个人的小tips:

    ①减小系统误差:一般设计3个重复孔,但是后期我统计数据时发现,误差bar仍可能较长,这时我们可以设计4个复孔,去除一个误差最大的值也有助于结果的准确性。这时就要求我们会更加精准的使用移液枪。另外,重复实验也有助于提高我们加样的准确性。

    ②制备预混液:例如我要做30(2×5×3)孔两个基因(包含内参),5个处理,3个复孔,那么我的荧光染料一个孔需要5ul,正反引物2ul,那么我们可以再不浪费试剂的情况下,计算量可为:15.5×5+15.5×2或者(15×5+15×2)×1.1,这一定程度上都是为了消除我们人为加样误差。

    ③另外我们尽量增大加样体积减少误差:针对于10ul体系,提前将正反引物混合,配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O,这时的体积为6+4或者7+3可减少加样体积小带来的加样误差。

    ④相关试剂使用前需离心使用:另外,在八联管上机前需要用干净的手套盖上透明盖子,适当离心将反应体系离心至管底。

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