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    免疫细胞转染后细胞毒性较高是为何?

    发布时间: 2023-01-05  点击次数: 52次
       免疫细胞转染时先吸去培养皿中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗⼀次。更换无血清培养基。准备转染制备液,⽤灭菌后的EP管制备。以六孔板为例,A液-200μl Opti-MEM稀释4μg质粒;B液-200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000,分别将A液、B液轻轻混匀,静置5min,吸取B液加至A液中,轻轻混匀,室温静置20min。
      加⼊转染试剂到每个孔的培养基中,6h后,更换成全培养基,继续培养到24-48小时。
      免疫细胞转染在转染24h后需要观察转染过程对细胞毒性情况,如果毒性较高,可能是以下原因造成的:
      1.初期细胞接种浓度太低。
      2.转染复合物加入量过高,因为不同细胞对转染的敏感度不同。
      3.转染后6小时需更换培养基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培养基需要更换成有血清培养基。其次,转染后需要对转染效率进行检测,比如观察转染后细胞荧光情况、qPCR验证或WB检测敲减或者过表达蛋白。
      4.对于β-gal表达载体:可用β-gal染色试剂盒进行细胞染色并观察细胞。转染效率高的细胞在染色孵育后3-4h即可观察到,转染效率低的细胞则需要更长的孵育时间。
      5.对于GFP表达载体:荧光显微镜下观察细胞。如果细胞能在显微镜下被观察到,至少需要有104-105拷贝的GFP蛋白表达,表达太弱的细胞无法镜检。GFP表达情况也能使用流式细胞仪进行检测,同时可加入PI进行染色以监测死细胞情况。
      若是转染后发现转染效率不高,可通过以下两种方法增强转染效率:
      1.复转染,即转染后12-24小时再次进行转染,前提是该细胞对脂质体的耐受性较好,转染后细胞死亡数较少;
      2.通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。
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