销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱

    DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱

    发布时间: 2021-08-24  点击次数: 3445次

    很多人拿到一个质粒图谱,第一反应只能是仰天长啸,这是什么玩意?这些 ori、RBS、tet 是什么鬼?这些箭头代表什么,转录的方向吗?为什么都不相同,不会“撞车"么? 来,看几张图,上面的问题就能一一破解。


    第一步:先了解质粒的基本组成元素。


    DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱


    1)复制起始点 Ori。该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数,它是质粒中一段特定序列,富含 AT 和重复序列。

    Tips:图谱上只有一个 Ori,表示质粒是原核克隆表达质粒;有两个 Ori,则表示该质粒是,穿梭质粒,即可在原核也可在真核中复制。

    2)抗性筛选基因。图谱中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因,方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。特点就是单词最后会以大写 R 或上标 r 结束。

    Tips:一般克隆载体只有一种抗性筛选标记,部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。

    3)多克隆位点(MCS),即一系列限制性内切酶酶切位点,是外源 DNA 插入位点,一般可通过酶切/连接方式将外源 DNA 插入质粒,外源 DNA 一般小于 10kb,而片段越长,转化效率越低。

    Tips: 一般位于转录启动和转录终止信号之间;所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异,且其中的酶切位点在质粒中为单一的酶切位点;同时在使用时需注意质粒载体与外源 DNA 酶切位点的兼容性问题荧光标记或蛋白标签序列。蛋白纯化标签蛋白:His-Tag,GST-Tag 等;蛋白检测标签蛋白:Myc-Tag,Flag-Tag,HA-Tag 等;荧光蛋白表达标签:GFP,mCherry 等。


    第二步:看质粒是否是表达载体,如果是,那就必定有这些原件:启动子-核糖体结合位 点-克隆位点-转录终止信号。


    DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱

    1、启动子:促进 DNA 转录的 DNA 序列,可与 RNApol 特异性结合。

    2、增强子/沉默子:前者是真核基因组中一种增强邻近基因转录过程的调控顺序,其作用与增强子所在位置或方向无关。后者是负增强子,负调控序列。

    3、核糖体结合位点/起始密码/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD 序列。

    4、转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA  的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加 尾信号。


    第三步:弄清楚方向,即为何质粒图谱上有的箭头顺时针而有的箭头逆时针。


    DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱

    其实那是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的某些基因在另一条链上。当然,最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段(从 T7 启动子到终止子那一段)的方向,即下图黄色圈圈所示的箭头方向,其它的大可以忽略。


在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]