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    琼脂糖凝胶电泳、酶和试剂的使用等一些注意事项

    发布时间: 2021-08-24  点击次数: 439次

    基因克隆在发明后的 32 年,需求一直不断增加,但是有些小伙伴的重组质粒就是怎么样都构建不出来。其实,看似简单的传统基因克隆,可是存在着重重陷阱!美国罗林斯研究中心 (Rollins Research Center)Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的经验: “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小编今天就把核心的 “姿势"给大家提炼出来,主要是琼脂糖凝胶电泳、酶(DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 连接 酶等)和试剂的使用等一些注意事项。


    琼脂糖凝胶电泳、酶和试剂的使用等一些注意事项

    ▲从 PCR 产物到质粒的工作流程


    1.聚合酶 

    DNA 聚合酶有两个对 PCR 过程不可少的附加属性,但是不利于后续克隆的步骤。第一, Taq/DNA 混合物的解离常数在室温中是 20 nM,与扩增产物的终浓度相当,因此酶往往与扩增产物同时纯化。实际上,大多数其他商用 DNA 聚合酶与 DNA 结合的更加紧密。残存的聚合酶可以阻止限制性内切酶作用于 DNA 末端,或者填补突出的部分。第二,市场上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶热稳定性更高,在有机溶剂和离液盐中的构象稳定性也更高,PCR 产物的纯化更加困难了。


    2.割胶回收 

    载体经过酶切后,需要经过凝胶纯化提高克隆效率。割胶回收对技术要求高,也很难自动化, 而且 DNA 暴露在紫外光下会大大降低转化效率。凝胶纯化的产量往往有限,因此研究人员需要消化毫克级的 DNA,才能产生最后的终产物。残留的琼脂糖或凝胶提取过程中引入的各种溶剂和盐,可能抑制后续 T4 连接酶的活性,从而降低克隆效率。另外回收效率还与片段的长短相关,小于 500bp,或者大于 4kb 的片段,加异丙醇有助于提高回收效率。


    3.限制性内切酶 

    限制性内切酶的出现是为了保护细菌免受噬菌体及其他入侵者。因此,限制性内切酶/DNA 底物的 KM 值相当低(米氏常数 KM 值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度,是酶的特征性常数之一。KM 值只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境如温度、PH、 离子强度有关,与酶的浓度无关。Km 值愈小,酶与底物的亲和力愈大)。所以“提高酶切反 应中 DNA 的浓度,这样凝胶纯化的产物才足够连接反应使用"是错误的!在这种情况下, 限制性内切酶会受到抑制,从而导致不完全的消化。


    4.T4 连接酶 

    连接反应失败的原因有很多,但失败可能在加入 T4 DNA 连接酶之前就发生了:由于 DNA 聚合酶扩增不完全导致的末端不均一、酶切不完全、连接酶抑制剂或者突出的部分被补平。在某些情况下,连接反应失败可能是因为退火效率不够、反应缓冲液中的 ATP 浓度过低(室温孵育时间过长)或者酶可能变性了。T4 连接酶在室温下相当稳定,但如果被水而不是合适的 buffer 稀释后可不是如此。如果有问题,可以通过阳性对照来检测酶的完整性:


    琼脂糖凝胶电泳、酶和试剂的使用等一些注意事项


    5.感受态细胞转化 

    在克隆过程中,具有高效转化效率的感受态细胞至关重要,这对于之前并不高的分子克隆效率具有一定的补偿作用。最常见的两种转化方法:热激转化和电穿孔。电穿孔是*的,更重要的是,转化细胞的数量与 DNA 的量成正比,可以达到微克级别,且不会出现热激中 出现的菌株效应或者对质粒的长度有限制,所以对于困难的克隆项目,电穿孔无疑是首先选择的方法。不过虽然热激转化效率不及电穿孔,而且会因 DNA 过量(>10ng/200μl 感受态细胞)而抑制转化,但是它方便啊!“冰一冰、热一热、凉一凉、加一下再摇一摇"就搞定了,所以还是有很多人使用这个方法的!


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