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    【技术】酶切、酶切,切还是不切?

    发布时间: 2021-08-24  点击次数: 2203次

    酶切,作为一种常用的分子克隆的手段,如果应用得当,可谓宝刀屠龙,无往而不利;如果应用不当,又会步步维艰。真是让人欢喜让人忧愁。酶切,最常见的问题就是切不动和切过了。这些问题比较复杂。下面,先讲一讲切不动的问题。


    切不动可能的原因:

    1. 酶不匹配

    解决的方法:如果是双酶切 A 和 B,预实验中必须做 A 和 B 各自的单酶切和 A+B 的双酶切, 好确认这几种酶都好用,质粒上的切点都好用。

    2. 体系的问题

    解决的方法:酶切尽量用大体系,如 50ul、100ul 等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油,对反应有利。

    3. 酶的量太少

    解决的方法:当设计一个酶切时,限制性内切酶的用量是与 DNA 分子的大小和量密切相关的。根据每种酶的单位定义,精确计算出所需的限制性内切酶的量。不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“,那个通用酶切方案是很多酶切切不动的原因。这里,小编隆重推荐一款酶切利器:3D(Double Digestion Designer)。该软件的一个主要功能就是根据不同限制性内切酶的单位定义,以及你底物 DNA 分子的大小以及 DNA 的量(ug数)来精确计算出完全酶切你的 DNA 底物所需要的酶量,为完全酶切提供夯实保证。

    4. 酶失活 

    如果限制性内切酶因为保管不当,导致酶失活或部分失活,那么依据 3D 计算出来的酶量就不能保证完全酶切。解决的方法:保管好你的酶。如果过期了,就不要用了。

    5.DNA 的问题 

    如果制备的质粒 DNA 的质量不好(如细菌培养时间过长,质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等),那么对这种质粒 DNA 进行酶切时,即使酶活性正常,酶量足够,也不能实现完全酶切,因为其中很多质粒 DNA 已经变性,不能被切开。


    下面,给大家看一个简单的实例。 

    如果要用 AcsAB + pSB1C3 对质粒 DNA 进行双酶切,以便进行某基因的克隆。 

    那么,应该同时设计并进行三种酶切反应:

    A: AcsAB + pSB1C3 双酶切 

    B: AcsAB 单酶切 

    C: pSB1C3 单酶切 

    在酶切时,A,B,C 三种酶切反应都用相同的 buffer 系统,相同的 DNA 量(建议至少 0.5ug),所需的酶量用 3D 进行计算。在合适的温度(37°C)酶切 1~2 个小时,然后进行电泳分析。电泳分析时,添加两种对照:未酶切的质粒 DNA 和分子量标准(Marker)。


    根据电泳的结果,就可以知道酶切是否完全:


    如果一切正常,完全酶切后电泳的条带分布如下: 

    1.单酶切(B 和 C)应该只有一条线性化的 DNA 条带,其大小与质粒的理论长度一致; 

    2.未进行酶切的质粒 DNA 应该主要是一条超螺旋条带,其电泳位置应该在单酶切产生的线性 DNA 分子的前面。(有的质粒会在超螺旋条带的后面出现线性化条带和环状 DNA 条带); 

    3.双酶切的条带应该只有一条带,而且大小与单切的位置一样(注意:只有当两个酶切位点间没有大片段插入时,才如此。事实上,大部分质粒的多克隆位点都是如此)。


    【技术】酶切、酶切,切还是不切?


    如果出现以下的情况,就表明有问题: 

    1.单酶切后(B 和/或 C),与未酶切的 DNA 样品(D)的电泳位置一样(即依然为超螺旋) 

    2.出现线性化质粒及超螺旋质粒两条带。这意味着:AcsAB 和/或 pSB1C3 未能完全切开,原因可能是酶部分失活,或者质粒的质量有问题。此时,即使双酶切只出现一条线性化 DNA 条带,也可能在线性化质粒中存在大量的单酶切的载体。 用此种载体进行克隆,则在连接时会出现大量的单酶切载体的自连(载体自连的效率较双片段连接高 10 倍以上),导致大量的自连克隆,很难挑选到有插入的克隆(克隆失败)。如果出现此种现象,建议不要盲目地做下去。应该先停一停,首先逐一查找可能的原因。只有当上述两种可能的问题都解决了,才能保证完全酶切,进而获得正确的克隆。


    以上是酶切的常规经验,当然还是会有特例比较难做,因为其中涉及到酶量的计算,Buffer 的选择,反应体积,反应条件等多种条件摸索。一旦出现问题,大家需要耐心细致,逐一查找可能的原因。

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