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    如何解决酶切切过头的问题?

    发布时间: 2021-08-25  点击次数: 1642次

    之前谈到了酶切切不动的问题。这一次,我们探讨一下酶切的另外一端:酶切切过头的问题。还是按照一贯的做法和思路,发现主要是两个原因导致的,解决办法也是有的。


    一、酶切时间过长 

    酶切时间过长的确有时候会对目的条带有影响,因为你用的酶可能会有星号活性。那么什么叫星号活性呢?通俗一点讲,就是酶不去切它该切的地方,瞎切一气......酶切时间过长,会导致最后乱切。安培建议:双酶切不要超过 5 小时。其实一般 3-4 小时足够了。你应该有提供给你酶的生物试剂公司的相应的说明书的吧?上面都有写明酶的活性和作用时间。现在的酶都很不错的,10 到 15 分钟就可以都切完。一般只水浴一个小时,不会再长了。 如果时间太长,就会造成下图所示的情况。注意第四泳道红框标注的地方。居然切出了 5 根 条带。这显然是时间过长了。


    二、酶量过多 

    和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性)一样,酶加多了也会产生星号活性。一般来说,所加酶的体积不能超过酶切总体积的 1/10,否则甘油浓度会超过 5%,会产生星号活力。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过 5%,也就是说 10ul 的体系, 酶的用量不要超过 1ul。

    以 TAKARA 的酶为例,其对 1 单位酶的定义如下:在 50 μl 反应液中,30℃温度下反应 1 小 时,将 1 μg 的 λDNA 完全分解的酶量定义为 1 个活性单位(U)。 而该酶浓度约为 15 U/μl。 在除外酶降解的因素外,理论上,该酶可分解 15μg 的 DNA。而一般从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3μg,而 PCR 纯化后的产物(50 体系)约为 3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的质量非常好,酶切也完全切得动。注意,不要加多了呀。

    但是给推荐的一般都是 20 ul 体系加 1ul。 其实,在 20ul 只加 0.5ul 酶,切的效果也很好。

    其实,除了考虑酶浓度(每 ul 多少个单位)以外,还应该考虑这种酶在 λ DNA 上的酶切位点数目。比如用 Hinc Ⅱ和 XbaI 双切 pUC118,这两个酶在 pUC118 上都只有一个酶切位点, 而在 λDNA 上的酶切位点分别是 35 个和 1 个。根据酶活性的定义,相同单位的 Hinc Ⅱ和 XbaI 对 pUC118 的酶切效率是 35 比 1,所以在双酶切体系中,所用的 Hinc Ⅱ显然应该要少很多。举这个例子,是想说明:大家再考虑酶浓度的时候,应该多想一层。


    综上所述,酶切切过头了的原因,其实并没有酶切切不动那么复杂。不外乎时间过长和酶量太大。童鞋们只要注意一些,一般都没有问题。

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