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    电泳中的异常现象及其原因分析

    发布时间: 2021-08-26  点击次数: 1878次

    跑电泳是分子生物学实验的一项基本技术。只要做分子生物学方面的实验,可能或多或少,或早或晚都要跑跑电泳。有时候,跑电泳跑着跑着也会出现一些奇奇怪怪的现象。下面,谈一谈跑电泳的过程中可能会发生的异常现象,可能的原因,以及处理的方法。


    1. 加样孔有荧光 

    下图的红框部分就是一个典型的加样孔有荧光的例子。发生这种现象可能的原因如下:

    电泳中的异常现象及其原因分析

    首先一定有 DNA 的滞留,其次多含蛋白质残留;如果是比较特殊的样品,其杂质也可能致荧光。蛋白质几乎不会被 EB 染色,能出现荧光,则一定含有核酸。非常巨大的基因组 DNA  (>50kb),如果使用普通的琼脂糖电泳,往往不能电泳出孔,单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。更多的时候,是比较大的 DNA 与残留的蛋白质结合后,电泳不能出孔而在孔中产生荧光。酶反应产物,如果没有经过纯化去除酶,也非常容易在孔中出现荧光,其原因是酶与 核酸几乎都有比较强的结合能力(基因组 DNA 的 PCR 产物电泳往往在孔中都有荧光,而且荧光强度与体系的特异性成反比)。如果是植物样品,还可能由其它杂质残留引起。


    那么,这么多种可能性。到底是什么东西残留呢?过往的经验是:蛋白质残留的荧光有点发闷,其它杂质残留亮得很刺眼,且薄得锐利。如上面那个例子,这么亮,这么锐利,肯定不会是蛋白质啦。


    2.总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮 

    如下图所示,18S 明显地比 28S 亮了。

    电泳中的异常现象及其原因分析

    如果 28S 和 18S 的条带清晰无弥散,那么多提示 28S 没有被 EB 饱和。RNA 残留多时,基 因组 DNA 的电泳也会有相似现象。解决方法:简单的补染就可以解决此问题。再次电泳时, 或者降低上样量,或者直接增加胶中 EB 的量。保证 28S 比 18S 亮堂很多很多。


    3. 降解 

    降解的现象,其实是千奇百怪的。可以简单总结如下:主带不再突出,向小片段方向发生弥散,亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象,则需要更进一步的检测:加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。 如下图所示,红框里面的就是典型的降解的现象。

    电泳中的异常现象及其原因分析

    其实,以现在的裂解液的裂解能力而言,降解的发生主要是在彻底匀浆之前,只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例,总 RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁 细胞、组织。彻底裂解悬浮细胞的时间最短,彻底裂解组织的时间最长,这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品,非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量;但是,有许多实验室并不具备严格的保存手段,实验人员的操作也并非完好,其结果就是核酸的降解。


    事实上,RNA 抽提受的影响因素太多,就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液,无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品,如果混匀彻底,可以预期的降解为:细胞:不应该降解,碾碎的组织:不应该降解,大块组织:部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象,该现象是假象;如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象,该现象不是假象,就是样品在保存中已经降解了。即使蛋白酶 K 失活了,消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解。


    说了这么多。那么,如何才能减少或者杜绝核酸降解呢?那就是:一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面写的 RNA 的提取一节里面已经说过了,不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。越快越好。

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