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    【RNA提取】RNA抽提的三大纪律八项注意!

    发布时间: 2021-08-30  点击次数: 1670次

    今天我们谈一谈 RNA 抽提的问题。为了方便大家记忆,总结出了“三大纪律八项注意"。


    纪律一:无外源酶的污染。 

    外源酶会造成 RNA 的降解,造成 RNA 得率太低,或者彻底失败。而外源酶又是无处不在的。这就要求注意以下三点:

    注意一:严格戴好口罩,手套。手指和呼吸时重要的外源酶的来源。所以童鞋们做 RNA 抽 提的时候,还是要全副武装起来。这对自己也是一种保护措施。 

    注意二:实验所涉及的离心管,枪头,移液器,实验台面等要彻底处理。离心管和枪头要用 DEPC 处理过,单纯的消毒灭菌可不行呀。移液器和实验台面等要用 75%的酒精擦过。 

    注意三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。


    纪律二:无内源酶的活性。 

    这个和纪律一是一脉相承的。目的都是减少 RNA 的降解,提高最终的得率。而所有的组织都含有内源酶,这就要求我们在实验过程中,千方百计灭活内源酶。这也就诞生了下面的四大注意事项: 

    注意四:选择合适的匀浆方法。新鲜样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至-70℃ 冰箱保存。在碾磨前,碾磨用具也必须预冷。在碾磨过程中,一边碾磨,一边补充液氮。样品碾碎后,在液氮刚刚挥发完时,将样品迅速转移到含裂解液的容器中,立即混匀匀浆。

    注意五:选择合适的裂解液。现在市场上常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性。但是,高内源酶含量的样品,如肝脏,脾脏等组织,建议使用含苯酚的裂解液。苯酚的灭活内源酶的能力是很强的。 

    注意六:控制好样品的起始量。如果样品的块头太大,所有的细胞无法迅速和裂解液接触。里面没有接触到细胞的 RNA 很快就会被内源酶降解。所以,起始量不要太大。如果块头太大,要把它切成小块小块的。


    纪律三:明确抽提目的。 

    我们做每一个实验,甚至每一个步骤,都要清楚这样子做的目的是什么。RNA 用于不同的实验,其质量的要求是不一样的。那么,这就诞生了下面的最后两条纪律: 

    注意七:任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,抽提成功率急剧下降。所以,要进行样品的破碎和匀浆。其目的是为了使 RNA 彻底地完整地释放出来。如果样品是细胞,则无须破碎即可直接匀浆;如果是组织,甚至器官,那就需要破碎后才能匀浆;如果是酵母菌和细菌,则需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。

    注意八:RNA 抽提成功的一个经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。我们为什么要抽提 RNA?是为了后面的实验,例如原位杂交,免疫沉淀等等。所以,一定要明确后面到底是要干嘛?cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留;Northern 对 RNA 完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高,但对酶 反应抑制物残留要求严格。不用每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的,从而造成不必要的浪费。


    综上所述,对大部分实验者来说,RNA 抽提比 DNA 抽提要困难得多。所以,我们要个个牢记,三大纪律八项注意。

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