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    【干货】RNA抽提原理和流程

    发布时间: 2021-08-30  点击次数: 2329次

    现在我们所熟知的 TRIzol 是 Life Technologies 公司的商品名,而同样的试剂在 Piotr  Chomczynski 创办的 MRC 公司则被命名为 RNAzol(据 Piotr Chomczynski 透露,他们已经将 RNAzol 改进,使抽提得到的 RNA 无基因组 DNA 残留)。事实上,这种 RNA 抽提的方法应该叫做“异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法"


    TRIzol 作用原理: 

    在匀质化或溶解样品中,TRIzol 试剂可保持 RNA 的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。RNA 存在于水相。水相转移后,RNA 通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇沉淀可从中间相得到 DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。


    需自备的耗材试剂: 

    o RNase free 的一次性带盖透明聚丙烯管 

    o RNase free 的枪头 

    o RNase free 玻璃瓶:玻璃瓶 200°C 烘烤 2h 即可去除 RNase,塑料瓶盖可浸泡 10 分钟 的 0.5 M NaOH 溶液,然后用 RNase free 水彻底冲洗,并高压蒸汽灭菌。 

    o 氯仿 

    o 异丙醇 

    o RNase free 水:即 DEPC treated 水。把水加入 RNase-free 玻璃瓶中,加入 0.1%(v/v) DEPC 用力摇匀,37°C 过夜,高温高压灭菌。灭菌时瓶口需拧松,DEPC 受高温会分解出大量 CO2,注意安全! 

    o 75%乙醇(无水乙醇溶于 RNase free 水中)


    简明抽提流程: 

    裂解 

    a) 新鲜取材的组织液氮急冻后,每 50-100mg 组织加 1ml TRIzol,使用强力匀浆机匀浆;

    b) 贴壁细胞则弃培养基后每 87.5px 皿中加入 TRIzol 试剂 1ml 吹打裂解; 

    c) 悬浮细胞则离心沉淀细胞弃培养基,每 5-10×106 个细胞中加入 1ml TRIzol 吹打裂解。

    Tips:使用 TRIzol 试剂前避免洗涤组织和细胞,因为这增加了 mRNA 降解的可能性。

    ↓ 

    室温孵育 5-10min 

    ↓ 

    每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿,用手大力摇管 15s, 室温孵育 2-3min 

    ↓ 

    2-8°C、12000 g×15min


    离心后,混合物分离为下层红色的酚-氯仿相、中间相以及上层无色水相。RNA 存在于水相。

    ↓ 

    转移水相到一个新管,加入 500ul 异丙醇上下颠倒混匀,室温孵育 10min 

    Tips:转移水相时,枪尖随着液面下移而下移,避免扰乱分层,慢慢吸取,避免吸到中间相和下层有机相,更不要贪心吸太多,吸大约 400ul 就好。 

    2-8°C、12000 g×10min 往往离心前 RNA 不可见,离心后再管侧面和底部形成白色沉淀 

    弃上清,1ml 75%乙醇洗涤一次,2-8°C、7500 g×5min

    Tips:加入 75%乙醇时轻轻加进去就好,尽量不要把 RNA 沉淀吹散,把沉淀保持在原位最好了,因为有时候 RNA 太少,吹散了再离心下来时 RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可见的沉淀,导致后面的“盲操作"。而不小心吹散的话也没关系,对 RNA 质量不会有影响。

    尽量吸除上清,室温干燥 5-10min,以 RNase free 水溶解,并保存于-70°C 

    Tips:密切注意 RNA 沉淀的干燥程度,不要完全干燥,这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值会偏低。最佳干燥度为 RNA 沉淀仍然是白色的,微微湿润呈啫喱状。


    OK,搞定!

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