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    RNA Trizol 抽提步骤

    发布时间: 2021-08-30  点击次数: 478次

    PCR、qRT-PCR 最最初始,都离不开 RNA 的抽提,RNA 质量的好坏,直接影响到后续的反转录及 PCR 等过程。很多时候,小伙伴们明明跟着 Trizol 步骤一步一步来的,谨小慎微,不敢懈怠,但就是 RNA 抽提不过关。其实 Trizol 抽提 RNA 是个细活儿,小伙伴们根据自身的实战经验,做一下优化很有必要~ 


    Trizol 标准抽提步骤(打勾勾的自然是要注意的地方): 

    1、将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min,使得核蛋白与核酸完全分离。 

    样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质,可以 12,000  rpm 离心 10 min,移去漂浮的油脂,取上清。 

    2、加入 0.2 ml 氯仿,剧烈振荡 15 sec,室温放置 3 min。12,000 rpm 4°C 离心 10 min。 

    如不能旋涡混匀,可手动颠倒混匀 2 min。 

    样品会分成三层:上层水相,中间层和下层有机相。RNA 在上层水相中。 

    3、吸取上层水相转移至干净的离心管中,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置 20 min。 

    不要吸取任何中间层物质,否则会出现染色体 DNA 污染。 

    4、12,000rpm 4°C 离心 10 min,弃上清。

    离心前 RNA 沉淀通常是不可见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 

    5、加入 1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心 3 min,弃上清。室温干燥 5-10 min。 

    75%乙醇用 DEPC 处理过的水配制。 

    通常 1 ml Total RNA Extractor 需用 1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。 

    不要倒出沉淀,剩余少量液体短暂离心,然后用枪头吸出,不要吸沉淀。 

    不要晾的过干,RNA 完全干燥后很难溶解,大约晾干 5 min 左右。 

    6、加入 30-50 µl RNase-free ddH2O,充分溶解 RNA。将所得到的 RNA 溶液置于 -70°C 保存或用于后续试验。 

    对于肝、胰腺、肾等组织中 RNase 含量很高,沉淀用 100%去离子甲酰胺溶解。


    额外的小 TIP~(第三步): 

    很多刚开始学抽提的小伙伴吸取上层水相总是吸到中间层物质。既然吸上层手容易抖,那不妨吸下层遗弃然后把剩余的再进行离心。这样多一步,离完心剩下的基本就是上层水相和中间层沉淀,再吸取想要的目标就能轻松改掉手抖啦~ 


    Protocal 改善的地方~(还是第三步):

    3、吸取上层水相转移至干净的离心管中,加入 2.5 倍体积乙醇,1/10 倍体积 3M 醋酸钠,以及糖原。混匀,-80°C 放置 30-60min。

    不要吸取任何中间层物质,否则会出现染色体 DNA 污染。 

    加入糖原,使溶液中糖原的最终浓度达到 50ng/µl。 

    混匀后,-80°C 放置 30 -60min,适当增长孵育时间或者降低孵育温度将有助于小 RNA 的沉降。 

    以取 500µl 上层水相为例,则需加入 1250µl 乙醇,50µl 醋酸钠以及 4.5µl 糖原原液(原液浓度为:20mg/ml)。

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