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    【技术】教你如何达到提取RNA的最高境界!

    发布时间: 2021-08-31  点击次数: 766次

    免除 RNase 的困扰 

    RNA 分子异常脆弱,很容易就会被无处不在的 RNase 降解,轻轻松松的就让实验人员的种种努力付之东流。尤其是当样品极其稀少且珍贵时,RNA 的降解更是让各位小伙伴们想自挂东南枝。因而 RNase 可谓是 RNA 提取的大敌,那么为了保护好 RNA 分子,就必须 把 RNase 给 KO 掉。


    当然针对外来的敌人,只要注意这三个小细节,那么绝对可以克敌制胜。 

    (1)严格戴好口罩、手套。手指和呼吸是外源性 RNase 的主要来源,所以在提取 RNA 时,一 定全副武装起来,才好擒获 RNA 分子。 

    (2)实验中所涉及的离心管、枪头、移液器、实验台面一定要经过彻底处理。比如,离心管和枪头要用 0.1%DEPC 浸泡后并高压灭菌处理,移液器、实验台面要用 75%的酒精擦拭过, 玻璃器皿应在使用前用 180℃的高温下干烤 6h 或更长时间。 

    (3)实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。另外,还需要注意 RNA 的保存时间,一般 RNA 37℃稳定存放 1 天,25℃稳定存放一周,4℃可存放一个月或-20℃长期存放。


    可是有时即便小伙伴已经如此小心翼翼了,RNA 分子仍会消失的无影无踪,细究其原因,才发现竟是内源性 RNase 在搞鬼,这不禁让人感叹道,不是我们太粗心,实在是敌人太狡猾。为了打击内源性 RNase 的嚣张气焰,我们只能千方百计的灭活内源酶,因而便诞生了以下三个妙招。

    1、选择合适的匀浆方法。新鲜样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后可移至-70℃冰箱中保存。在碾磨前,碾磨用具也必须预冷。在碾磨过程中,一边碾磨,一边补充液氮。样品碾碎后,在液氮刚刚挥发完时,将样品迅速转移到含裂解液的容器中,立即混匀匀浆。 

    2、选择合适的裂解液。现有市场上常用的裂解液几乎都能抑制 RNase 活性。但是高内源酶含量的样品,如肝脏、脾脏等组织,建议使用含苯酚的裂解液。苯酚的灭活内源酶的能力还是很强的。 

    3、控制好样品的起始量。如果样品的个头太大,细胞中就会有些“漏网之鱼"免于和裂解液接触,致使 RNA 很快就会被内源酶降解。因而,起始量不要太大,如果组织块过大,可以将切碎后再抽提 RNA。


    明确抽提 RNA 的目的 

    一般,抽提 RNA 的目的无外乎有两个。首先,最直接的目的就是要让 RNA 彻底地完整的释放出来。此时对样品的处理就至关重要,如果样品是细胞,则无须破碎即可直接匀浆;如果是组织甚至器官,那就需要破碎后才能匀浆;如果是酵母菌和细菌,则需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。 

    其次,RNA 在不同的实验中其质量的要求是不一样的,那么后续实验就是我们必须要考虑的。通常 cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留;Northern 对 RNA 完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。因而,不用每次实验都以获得最高纯度的 RNA 为目的,从而造成不必要的浪费。


    RNA 提取之疑难杂症 

    1、RNA 产量低

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    2、OD260/OD280<1.6

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    3、基因组 DNA 污染

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    4、RNA 降解

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    5、下游的 RT-PCR 实验不成功

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    RNA 电泳图谱剖析 

    提取RNA后,为了更好的进行后续的实验反应需要通过琼脂糖电泳来判断RNA质量的好坏。在此,将剖析电泳图上的秘密,帮助大家提高 RNA 抽提的成功率。

    1、RNA 条带不亮或缺失

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    原因分析:(1)上样量不足。(2)RNA 跑出凝胶。电泳至溴酚蓝至凝胶的 2/3 即可停止电泳。(3)RNA 在凝胶中发生扩散。避免长时间的电泳,否则小片段容易扩散。(4)RNA 降解。最大限度减少在紫外线下暴露的时间,使用新鲜的电泳缓冲液、新制的凝胶,电泳槽及制胶的模具梳子等用双氧水浸泡,高电压短时间电泳(20min)。也可能使用的组织材料不够新鲜(冷冻的材料必须在化冻之前将其磨碎)。


    2、RNA 条带弥散

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    原因分析:(1)RNA 被核酸酶降解。要用新的缓冲液,制胶用的模具要清洁,枪头要灭菌。( 2)电压过高造成电流过大所造成的。一般为 5—8V/cm。为了增加条带的清晰度,电泳开始的几分钟建议使用低电压。(3)上样量过大。根据沉淀量的多少确定点样的量,一般 1—3ul。


    3、点样孔发亮

    【技术】教你如何达到提取RNA的最高境界!

    原因解析:(1)上样量过大。(2)胶孔未凝固好,使样品无法往前移动。(3)RNA 样品中含有污染物,如残留的蛋白质容易引起此现象。可能 trizol 量太少,应加大 trizol 用量。另外若残留 DNA 也应考虑加大 trizol 用量。


    4. 出现多条带

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    原因解析:(1)RNA 降解。提取过程中出现降解或电泳过程中出现降解(可能性较小)。(2) 上样量过大。RNA 由多种类型组成,若上样量过大则会导致各种类型的 RNA(tRNA,mRNA 等)均会出现条带。


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