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    酵母杂交实验——从一无所知到略知一二

    发布时间: 2021-09-03  点击次数: 276次

    低分文章要想逆袭,实现向高分文章的跳跃,就一定少不了要将细胞豪门中分子间错综复杂的关系屡屡清楚。为了找寻能让自家目的蛋白荣登科研“头条榜"的“花边新闻",一众科研者可谓是操碎了心。庆幸的是,酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid,Y2H)和酵母单杂交(Yeast One-Hybrid,Y1H)实验让蛋白质与其好友(蛋白质、DNA、RNA)的关系在科研者面前变得无所遁形。


    蛋白钓鱼术——酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid,Y2H)

    通常一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白,但最终还是会有个最喜欢的,而在 Y2H 中就能发现他的喜好。换言之,Y2H 就是研究一群男女间的自由恋爱问题,而它为两个蛋白牵线拉桥的方法,简单概括起来就一句话:广撒网,钓大鱼。

    首先,把目的基因构建成 DNA 结合质粒(BD 质粒)转入 a 型酵母中形成钓饵(Bait);其次将全 cDNA 片段构建的转录激活质粒(AD 质粒)转化到 b 型酵母中,每个 b 型酵母含有一个随机的 AD 质粒,就形成了酵母库;最后利用酵母接合生殖的特征使得 AD 和 BD 两个质粒 同时进入到一个酵母中,当目的蛋白和酵母库中 AD 质粒所表达的蛋白相“合拍"时,质粒上的氨基酸合成基因就会被启动激活,使得酵母可以在营养缺陷型的培养基上生长了,这样就 弄清楚谁才是目的蛋白的“命中真爱"了。 

    然而在 Y2H 中,由于酵母库的构建是通过 cDNA 片段链接到质粒上的,经常会产生 2/3 移码突变的假阳性。因而,在研究蛋白质互作过程中,在用 Y2H 来筛选出相关蛋白后,还需用 Co-IP 和 GST pulldown 进行验证,看看目的蛋白对“真爱"是否做到了“没有你不行"又或者可能“脚踏两只船"还拥有其他的新伙伴。总之,只有依靠缜密的阴性、阳性对照才能真正在蛋白实验中披沙拣金、去伪存真。



    DNA 识别者——酵母单杂交(Yeast One-Hybrid,Y1H)

    而一提及蛋白质与 DNA 之间千丝万缕的关系,各位小伙伴立刻会向 ChIP-qPCR,ChIP-RNAseq 或荧光素酶报告实验等“神助攻"来寻求帮助。 

    可是你造么?通过酵母单杂交(Y1H),可快速鉴定与感兴趣的特定调节 DNA 序列(bait 序列)相互作用的蛋白质,除了“明星蛋白"异源转录因子,还可找到一些其他“幕后英雄",如 DNA 复制蛋白、修复蛋白及抑制蛋白。更重要的是,Y1H 还有着一项得天独厚的优势:可检测蛋白异构体(isoform)与 DNA 特异性相互作用,而这正是依赖于敏感和特异性抗体绑定到特定靶蛋白的 ChIP 很难做到的。

    举个栗子,当通过各类芯片筛选出了一个在肿瘤组织中异常高表达的差异基因 A,可通过 Y1H 实验为其组织一场相亲大会:即将构建含有报告基因(基因 A 作为 Bait 序列)的酵母单细胞株,与后续导入该菌株的表达特定蛋白的表达质粒库“见面",如果某蛋白能与上游的 Bait 序列“情孚意合",可使融合激活结构域(AD)与报告基因的启动子元件紧密接近,从而激活报告基因的下游转录,使得酵母可以在营养缺陷型的培养基上生长。接下来就可对该蛋白调控基因 A 的机制进行深入研究。 

    然而,任何筛选都存在假阳性,Y1H 也不例外;且 Y1H 不提供关于 DNA-蛋白质相互作用的功能性后果的任何信息。可见在生物实验中,单一的证据都是薄弱的,无论它貌似多么正确,也要通过对照和多方取证才能确定真正的事实。 



    升级版——酵母三交技术(Yeast Three-hybrid,Y3H)

    目前,从基本科学和临床角度上,通过 Y3H 来理解与 RNA 病毒相关的疾病过程是很重要的。而在具体的实践过程中,Y3H 可以用于筛选 RNA 文库以及 cDNA 文库。由于 Y3H 在现阶段还是一种新技术,所以迄今为止对其的相关报道还是比较少的。


    参考文献: 

    1)An Overview of Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening 

    2)An overview of the Yeast one-hybrid assay 

    3)Two Hybrid Services

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