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    免疫组化结果分析应该注意的一些事项和技巧

    发布时间: 2021-09-08  点击次数: 463次

    很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析,得出理想的结果。这实在是一件憾事。其实,免疫组化结果分析的 protocol 教科书和实验手册上面都有。今天主要谈谈应该注意的一些事项和技巧,并且有独门绝招献上,都是干货哟。


    对照染色 

    和做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身对照。一般来说,有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。 


    定位 

    抗原表达必须在特定部位。如 LCA 应定位在细胞膜上;CK 应定位在细胞浆内;PCNA 及 p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办?这就要用到上一段提到的对照染色了。


    半定位 

    现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3 计算出数值;总数值 <1.0 者为(+),1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)。


    图像分析仪 

    如果要进行精确定量的话,就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实最想推荐的是一款图像分析软件:Image J。这是 NIH 开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。网上可以免费下载。其界面非常简洁。

    现在,根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像分析。如我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么,如何用 Image J 来计数细胞的个数呢?

    首先,要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下:Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后,将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下:Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标,直到所有的细胞被标示出来。有时候 2 个细胞靠得比较紧密,会被计数为 1 个细胞。这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。步骤如下:Image→Binary→Watershed。这些是本来计数成一个的细胞,经过水洗之后,更加精确地被计数成了 2 个细胞。

    然后,就可以正式开始分析了。步骤如下:Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前,还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞,那么 Size 项里面选择“0-infinity"。 Circularity 的默认值为“0.00-1.00"。一般就取默认值。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像,所以就是每个细胞的面积。



    免疫组化是个苦活,时间长,步骤多,还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子,最后都希望得出自己想要的结果。以上介绍了一些心得体会。希望广大的同学们都能做出自己想要的结果,早点发文章。

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