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    免疫组化之8大疑难解答

    发布时间: 2021-09-08  点击次数: 271次

    IHC 常见的 8 大疑问


    Q1:冰冻切片和石蜡切片如何取材? 

    Answer: 冰冻切片取材可分为两种情况:1)动物灌流固定:如小鼠心脏灌流,首先采用预冷的 1×PBS 灌流冲洗直至血液全部放出,随后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直,而后解剖获取组织,于 4℃、4%PFA 中固定 1h 左右,1×PBS 洗 5 次(30min/次),25%蔗糖溶液脱水 12h 左右包埋即可。 2)直接取材:直接选择新鲜组织进行冰冻切片,此时不需要进行抗原修复。缺点:切出的片子含水量会比较多,形成冰晶影响结果,而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。石蜡切片:动物组织取材(灌流与否都可以,并不影响后续的操作)后,置于 10%福尔马林溶液中固定 3-4 天后,脱水,包埋,即可进行石蜡切片操作。 


    Q2:石蜡切片和冰冻切片的区别比较 

    Answer: 1)石蜡切片制备过程较复杂,抗原活性差,但切片薄(3-5μm),便于观察细胞的细微结构,且常温保存即可,非常方便。2)冰冻切片较厚(8-12μm),操作简单,抗原活性好, 但是保存时间短,且一定放在-80℃的低温冰箱中。


    Q3:一抗的选择要点是什么? 

    Answer:1)一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对低;而多克隆抗体特异性弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可通过封闭来避免)。2)抗体的比例可依据抗体说明书或 western blot 的抗体比例来做即可。3)对于组织样本,一般要在 37℃孵育 1-2h 或 4℃冰箱孵育过夜(效果较为佳,且拿出后需 37℃复温 45min),并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的,在第二天还需将湿盒置于室温孵育。


    Q4:如何选择封闭血清? 

    Answer:封闭血清一般是和二抗同一来源,可封闭非特异性结合位点,降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗的来源一致。


    Q5:DAB 显色时间如何把握? 

    Answer:可选择一张阳性的片子,用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后,再对所有片子进行显色,采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜,操作无误,10 分钟内肯定能够显色,如果超过该时间,说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短,则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长,需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。


    Q6:IHC 复染时间的选择? 

    Answer:苏木素复染时间一般为 5min 左右,可调整,染色时间太浅,可延长时间,反之缩短时间;随后进行盐酸酒精分化,数秒即可,自来水洗,最后置于氨水中返蓝。


    Q7:免疫组化的结果如何分析? 

    Answer:1)必设对照组。如阴性、阳性及自身对照。

    免疫组化之8大疑难解答

    由表中可知,只有 6、7 实验结果有意义。1-5 均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因 ICH 技术操作存在错误等而使实验结果失去意义,则必须重复实验或换用抗体。 2)阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下,随机选择不重叠的 10 个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组 3-6 张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。 3)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。 4)分级法。免疫组化的半定量一般分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3 计算出数值;总数值<1.0 者为(+),1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)。


    Q8:IHC 常见的疑难杂症有哪些? 

    Answer:

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