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    蛋白样品的制备与定量

    发布时间: 2021-09-14  点击次数: 641次

    (1)提细胞蛋白 

    ① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中,标记,10000r 离心 2min,PBS 洗 3 遍

    ② 吸去 EP 管中 PBS,最好用滤纸吸干里面的水分,加适量 RIPA 裂解液(RIPA 裂解液:蛋白酶抑制剂=250:1),如果你想做信号通路指标还得再加上磷酸酶抑制剂(磷酸酶抑制剂: RIPA 裂解液=1:1000) 

    ③ 冰上裂解 30min~1h,开 4°离心机 

    ④ 4°离心 11000r,20min 

    ⑤ 测蛋白浓度,取上清,加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer,煮沸,分装(蛋白质变性)


    (2)提组织蛋白 

    ① 研钵中倒入液氮,加入组织块,研磨,加液氮,药匙刮 

    ② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管,加适量裂解液,吹打 

    ③ 冰上放置 1h,期间,每隔 10~15min 吹打一次,开 4°离心机 

    ④ 4°离心 10000r,1h 

    ⑤ 测蛋白浓度,取上清,加 1/4 体积 5x loading buffer,煮沸,分装


    (3)测蛋白浓度(BCA 法) 

    ① 八个标准孔,按说明书先加超纯水,再加标准蛋白液 

    ② 目的孔,每孔加 18ul 超纯水+2ul 目的蛋白 

    ③ 按说明书配 BCA 工作液,每孔加 200ul 

    ④ 37°放置半小时后测浓度


    (4)计算上样量,设计上样顺序 

    上样体积:上样量/浓度 x 5/4

    上样顺序:无处理,对照,处理;体积最好不要相差太大


    经验总结: 

    如何提高蛋白浓度:首先当然是多种点细胞啦,其次可以少加点裂解液,尽量裂解充分。如何处理蛋白浓度低的问题:实验过程中发现蛋白的浓度太低,如果上样的话,体积太大,甚至电泳孔都装不下,举例:假设我需要上样 40ul 才能达到 20ug,那么显然按照常规的方法,10 孔的梳子只能加 25ul 左右,我们此时可以取 40ul 蛋白入 EP 管中,放置于 PCR 仪器,变性温度浓缩蛋白体积,这样不断浓缩之后促使 EP 管中蛋白的水分降低,蛋白量依旧是 20ug。如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的:种植细胞的时候尽量保持铺下去的细胞数接近,收细胞之后观察细胞的多少适当加入几倍体积的裂解液。 


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