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    分享总结Western跑磷酸化蛋白的要点

    发布时间: 2021-09-17  点击次数: 663次

    抗体 

    工欲善其事必先利其器,抗体很关键。这里我们要说的并不是最贵的就是好的,如果条件允许,建议同时购买不同厂家的抗体,一起来试一试,因为有时候即使是好的品牌,不同批次稳定性也不一样。抗体从订购到到货有一定的时间,所以到货后请尽快分装好,准备做实验,如果实验进度跟不上的问题,导致抗体到了后拖了很久才正式实验,这样拖了时间找厂家售后申诉也是很被动的。用 CST 的一抗,效果不稳定,也可能跟抗体放久了有关。最后买了另一家代理的抗体算是有了比较稳定的结果。当然,还是选择购买口碑较好的公司的产品为佳,这样即使出了问题售后也会跟进。如果经费有限,可以买买小包装的产品先试试,不少抗体公司还有 5ul 的抗体试用装免费申请。再者,孵育一抗的时候,建议用新鲜抗体,什么意思呢?很多同学因为想图省事儿,很多时候配好孵育液,每次孵育好之后再次放进冰箱等待下次重复利用,一些比较好跑的蛋白到时没啥问题,但是磷酸化的蛋白建议每次都用新鲜的抗体原液,将条带剪下来后用杂交袋塑封 好,按 1:1000 的比例加入抗体原液孵育,再这种情况下,100ul 的抗体也是能用很久的,所以尽量每次都用新的抗体。


    蛋白上样 

    普遍反映磷酸化的条带很淡,有时候达不到制图标准,这点可以加大上样量来解决,另外,磷酸化蛋白一般与非磷酸化的蛋白一起跑一起制图,它本来就是要比非磷酸化的要淡一些,不要过分担心。 


    电泳 

    不同 kb 的蛋白电泳时间有所差别,参数啥的要用脑子更改,不能一成不变,避免发生那种蛋白跑不见了的惨剧。 


    封闭

    这个步骤非常重要,强推 BSA 封闭,不要用脱脂奶粉封闭,BSA 封闭对磷酸化的抗体效果非常好,而且也不贵。另外,BSA 封闭液倒是可以反复使用不至于向奶粉一样臭掉,用来孵育一般非磷酸化的抗体,效果同样棒棒哒! 再者,封闭时间可以延长,一般封闭 2-3 小时的情况下,可以封闭延时到 4 小时,所以按照从早到晚做实验的时间,用 BSA 配好封闭液开始封闭的时候,您就可以慢慢的约个火锅唱个歌再回来了,实验本来就很辛苦,不要再依赖外卖小哥了。 


    洗膜 

    严格遵守洗膜时间,不得减少次数,每个步骤洗 3 次,每次可以洗长一点,比如(11-12 分钟)。

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