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    如何优雅地获得漂亮小分子蛋白条带

    发布时间: 2021-09-17  点击次数: 219次

    做过 Western-Blot 的童鞋知道,分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍,我待小分子蛋白如初恋。抱怨是没用的,想方设法解决问题才是正道。一次又一次的调整方案,一次又一次的徒劳无功。在此,总结了小分子蛋白之路经验,供有需求的童鞋参考。


    一、提蛋白的过程在 30 分钟之内完成,提完蛋白立即加入上样缓冲液煮沸(煮沸的时间长一点,一般 20 分钟),准备好蛋白样品后立即电泳。(小分子蛋白容易形成多聚体,这样可以大大减少多聚体的形成)。


    二、电泳时,电泳的时间要足够长。习惯是先用 60-80V 电压跑完浓缩胶,再以 100-120V 电压跑分离胶,溴酚蓝电泳至玻璃板底部。伯乐系列的电泳槽一般电泳 2 个小时左右,GE 以及百晶系列的电泳槽要电泳 4 到 5 个小时。电泳时要在冰水浴中进行。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的胶(若用 0.75mm 厚的胶时要适当缩短转膜时间)。


    三、转膜时,尽量用湿转法(半干转也可以,但是容易转过)。转膜缓冲液中,甲醇浓度要达到 20%。PVDF 膜,财大气粗的土豪可以用 0.22 微米的膜。对于我们大多数穷人来说,0.45 微米的膜也是可以的。以下是摸索出来的转膜时间(湿转法,0.45 微米的膜),供大家参考。


    如何优雅地获得漂亮小分子蛋白条带


    四、一抗孵育因为多数小分子蛋白的表达量较少,所以我一般孵育至少 48 个小时,甚至孵育 72 个小时。以上方法适用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa,则不用 SDS-PAGE 凝 胶电泳(蛋白与 SDS 共迁移,影响分离度,得不到很好的分离效果),应该采用 Tris-Tricine 缓冲系统与 Tricine 分离胶。具体操作步骤见《精编分子生物学实验室指南》338-340 页(这本书每个实验室必会备,若没有,可以在孔夫子旧书市场上买一本)。


    需要注意的是,Tricine 电泳时,蛋白样品用 Tricine 样品缓冲液处理,加样前在 37-40℃沙浴中处理一个小时(不要煮沸!不要煮沸!不要煮沸!重要的事情说三遍)。内槽中加满阴极缓冲液,外槽中加满阳极缓冲液(千万不要加反了。否则蛋白全部进入缓冲液!)。 

    最后,祝做小分子蛋白的童鞋实验之路顺利,早日做出满意的结果。

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