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    如何在WB中顺利获取大分子蛋白?

    发布时间: 2021-09-17  点击次数: 875次

    分子量大于 150Ka 的蛋白,经常折磨我们实验人。想当初,辛辛苦苦忙到深夜,结果发现显影空空如也。连续几个月如此,内心是何等抓狂。当大分子条带第一次出来的时候,心里特别开心,就像见到了初恋情人一样。看到周围有同仁受困于大分子蛋白,想一想当初所面对的困境。 

    在此,分享一下大分子蛋白的心得,希望这些经验对那些与大分子蛋白奋战的童鞋提供帮助。 

    提蛋白时应加入 RIPA 强效裂解液,在 4℃环境下静置的时间延长十分钟到二十分钟。这样可以充分裂解大分子蛋白(裂解不充分,大分子蛋白的电泳速度会很慢)。电泳时,电泳的时间要足够长。

    电泳全程采用 120-150V 的高电压,使 Marker 拉开足够大的距离。电泳时要在冰水浴中进行。 

    转膜时,湿转法与半干转法均可以(湿转法获得条带漂亮。半干转转膜效率高),转膜时,要保留分离胶(好多分子量超过 250KDa 的蛋白就残留在浓缩胶中!这是血的教训!当初好 几次傻傻的把浓缩胶扔了,结果神马条带都没有!)。

    先说湿转法,转膜缓冲液中甲醇浓度最高 10%,加入 SDS,使 SDS 终浓度达到 5%(大于 300KDa 的蛋白,转膜液中 SDS 的终浓度可以到 10%)。以下摸索出来湿转法的转膜时间(曾经试验过 30mA 小电流转膜过夜的方法,PVDF 膜上神马都没有。建议大家不要尝试!)。

    如何在WB中顺利获取大分子蛋白?

    用半干转时转膜效率高。恒压模式设置为 40V 电压,转膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能转到 PVDF 膜上。 

    或者用恒流法转,电流大小设置为 PVDF 膜的面积,转一个小时左右就可以出来。若怕转膜过头,可以将两张 PVDF 膜重叠起来(总会有一张膜上有条带)。 

    因为多数大分子蛋白是膜蛋白,表达较少,建议延长一抗孵育时间。有一次甚至孵育了四天才出结果。大分子蛋白与 PVDF 膜的结合不是很牢固,容易脱落,因此在洗膜时要操作轻柔,不要过于粗暴,否则抗原抗体复合物容易脱落。 

    这些经验是从几百次失败的实验中总结出来的,希望对大家有所帮助。实验失败不可怕, 重要的是要勇于面对,仔细思考,敢于改进。

    最后,祝大家实验顺利,早出漂亮结果!


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