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    清晰的条带是这样跑出来的——western blot八大秘诀!

    发布时间: 2021-09-17  点击次数: 1328次

    1.制胶:

    先制分离胶,再制浓缩胶,严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀!混匀!混匀!个人经验是每加一种试剂,就混匀一下,直到最后一种试剂加完。 

    对于初学者,还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的,两者需要的制胶液体量是不一样的。另外,玻璃板一定要洗干净,本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗,再放在烤箱里烤干并晾至室温。 


    2.点样:

    点样的过程很简单,表手抖就 OK 了。再者,点样的过程一定迅速,不然前面的样容易弥散,虽说不至于太影响结果,但对于有强迫症的同学来说还是比较致命的伤害。 


    3.跑胶:

    注意,跑胶时也会出现各种乌龙,如果跑了好大一会儿还不见条带下移,请看一下你的玻璃板是否放反;如果跑胶时发现温度过高,可检查一下正负极是否连接反了。跑胶建议恒压,80V 30min120V 60min(这个得具体看目的条带的 位置,时间可相应增减) 


    4.转膜:

    请牢记转膜顺序(黑色面-滤纸-海绵---海绵-滤纸-白色面),如若搞不清楚,可想象一下,蛋白质是带负电荷的,应该是往正极方面跑,所以膜应该放在正极面。转膜时要恒流, 285mA—300mA 60min。特别注意的是跑胶时恒压,转膜时恒流这个条件。 


    5.封闭特异性抗原:

    封闭和孵育抗体也是非常关键的步骤,封闭建议大家用 5%的脱脂奶粉, 2 个小时(或者过夜),不建议用 BSA。 


    6.一抗孵育:

    封闭完以后不用洗直接孵育一抗,一抗配置溶液是 3% BSA TBST(注意封闭和抗体孵育用的蛋白,封闭用牛奶,抗体孵育用 BSA,这个条件是决定条带是否齐整及有无杂带的关键),过夜(或 2 个小时)。时间上与封闭错开,如若封闭过夜,则一抗只需要两个小时。 


    7.二抗孵育:

    洗三遍后孵育二抗 1 小时,洗的时间很重要,习惯是洗三遍,第一二三次分别是 5min10min15min。还要特别强调的是,孵育和洗膜用的转速是不一样的。孵育是低速,使膜和抗体有充分的接触时间;洗膜时要用高速,以使膜洗得干净。还有,一抗孵育时正面朝下,封闭和二抗孵育时都是朝上。(表问为什么,不知道,经验之谈) 


    8.曝光:

    当满足了所有以上的实验条件之后,你就可以自信满满地去曝光了。相信我,不管是磷酸化的还是普通的蛋白,都会出现平整光滑的条带。


    最后说一下配置实验所需的各种溶液:TBST 可以买,也可以自己配置;同时 TBST 可以用 PBST 代替,即 PBS 加吐温就可以了。封闭和抗体孵育时所用的 5%的脱脂奶粉和 3%BSA 都是用 TBST 配置。洗膜时用 TBST PBST,这个就不用说了吧。

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