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    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    发布时间: 2021-09-26  点击次数: 598次

    作用原理

    高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1],聚合中心具有5’-3’聚合酶活性,负责聚合作用;酶切中心具有3’-5’外切酶活性(也称校对活性),负责将不配对的核苷酸予以切除。

    在PCR扩增过程中,当引物与模板完全互补后,进入聚合中心,在聚合酶活性作用下,游离的脱氧核苷酸通过互补配对原则,依次结合到引物的3’端,新链DNA从5’到3’进行延伸(图1-a);当引物末端结合的核苷酸与模板不配对时(图1-b),错配的核苷酸会翘起,新链DNA无法继续向前延伸,进而进入酶切中心,在外切酶活性作用下,错配的核苷酸会被切除(图1-c);切除后此位点会重新结合正确的核苷酸,新链DNA又能继续从5’到3’进行延伸(图1-d),最终使新链DNA能够进行精准复制[1-2]。

    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    图1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意图[1-2]


    应用方向

    基因功能研究

    案例:研究表明A基因可能参与拟南芥中花青素的代谢,为了验证这一假设,要先将A基因从拟南芥中扩增出来,构建到过表达或抑制表达载体上,通过农杆菌介导法转入拟南芥中,使A基因在拟南芥体内过表达或抑制表达,最后通过形态指标、生理指标及基因表达水平等来判定这一假设是否成立。


    基因测序

    案例:若想探究拟南芥中B蛋白家族中不同基因的异同点,需要先将B蛋白家族中的所有基因从拟南芥中扩增出来,得到这些基因的碱基序列,然后通过生物信息学分析来初步分析它们的异同点。

    以上研究均需借助PCR技术将目的基因从物种中精准扩增出来,如果扩增出的基因序列出现突变,那么后续分析都会不准确;为了保证目的基因的精准扩增,我们在PCR扩增过程中就需要使用高保真DNA聚合酶。


    此外,高保真DNA聚合酶也可以用于基因型鉴定。

    答疑剧场
    问Q1:高保真DNA聚合酶扩增产物为平末端,后续做TA克隆,如何在产物末端加A?

    答:反应体系:10 µl

    ①单酶:1 µl 10×Taq Buffer(MgCl2 Plus),0.5 µl dNTP Mix (10 mM),0.2 µl Taq DNA Polymerase,1-7 µl纯化后PCR片段,ddH2O补齐至10 µl


    ②Mix:5 μl 2×Taq Master Mix,1-5 µl纯化后PCR片段,ddH2O补齐至10 µl
    反应程序:72℃,10 min



    问Q2:高保真酶DNA聚合酶扩增的片段一定不会突变吗?

    答:高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性,在PCR扩增过程中可降低核苷酸错配的概率,保真度越高的DNA聚合酶,核苷酸错配的概率就会越低,但不表示扩增过程中绝对不会发生核苷酸的错配。因此,为了提高实验的成功率,建议同一样本挑取多个(>3个)单克隆进行测序。



    问Q3:不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性吗?

    答:高保真酶的保真度通常表示为是Taq酶的几倍,常见的保真度测定方法有:蓝白斑筛选测定、一代测序和NGS测序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度测定方法不同,若想要比较不同品牌DNA聚合酶的保真度,必须采用相同的保真度测定方法,进行平行比对。


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    参考文献:

    [1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理应用于SNP检测的研究[D]. 暨南大学, 2006.

    [2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.



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