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    成骨细胞原代培养实验步骤

    发布时间: 2021-11-15  点击次数: 201次

    材料与仪器

    骨标本
    Hams F12 培养液 用于细胞传代的胰蛋白酶液 分离成骨细胞的消化液
    Petri培养皿 培养瓶 手术刀 手术镊

    步骤

    一、外植块培养

    1. 从手术室获得骨标本。

    2. 在室温条件下,用无菌生理盐水浸洗骨组织数次。

    3. 如果骨组织不能及时使用,将骨标本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸链霉素的 Ham’s  F12 (添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg2+、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素)培养液中。骨标本可在 4℃条件下储存过夜。

    4 . 次日早晨,用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素的 Tyrode 液浸洗骨组织。

    5. 将骨组织放入 Petri 培养皿,用手术刀和手术镊取骨小梁,然后将骨小梁移入另一个 Petri 培养皿。

    6. 加入 10 ml Tymde 液,淹盖切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁数次,直至除去血液和脂肪细胞。

    7. 为了进行植块培养,将 2 ml 完全培养液放入 25 cm2 培养瓶,预孵育 20 min,以便用培养箱内的气体平衡培养液。根据需要,用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 调整 pH 。

    8. 将骨小梁切成 1~3 mm 小块。

    9. 吸去培养瓶内的预孵育培养液,然后加入 2.5 ml 新鲜的 Ham's F12培养液。

    10. 将 25~40 块骨小梁放入培养瓶。

    11. 将培养瓶直立,用接种环沿着培养瓶底壁滑动植块,使植块均匀分布。

    12. 在 37℃条件下,将培养瓶直立放置 15 min。

    13. 慢慢地使培养瓶恢复为正常的横置位。植块黏附于培养瓶底壁。

    14. 在37℃ 条件下,将培养瓶横置 5~7 d。此后,检査细胞长出情况,换培养液。为了预防植块脱离,在将培养瓶从培养箱移于超净工作台内或显微镜上之前,将培养瓶慢慢地直立起来。

    15. 每周换培养液 2 次,以维持培养。

    16. 细胞生长形成单层时,取出植块,用胰蛋白酶(将 125 mg 胰蛋白酶(XI型,Sigma)溶入 50 ml 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Tyrode 液。调整 pH 至 7.0,过滤除菌。用 Pyrex 管分装成 5 ml 和 10 ml,在 -20℃ 条件下储藏)消化细胞。通过离心分离细胞,然后将细胞接种于培养瓶或培养皿。

    二、分离细胞的单层培养

    1. 用 Tymde 液反复冲洗松质骨,洗去脂肪和血细胞。在无菌条件下,用手术刀和手术镊切除骨小梁。

    2. 取到较多的骨小梁后,用 Tyrode 液浸洗 3 次,洗去遗留的血液和脂肪细胞。将骨小梁切成 2~5 mm 小块。

    3. 用含有 FCS 的 F12 培养液洗骨小梁块。

    4. 将组织块放人盛有磁力搅拌棒的无菌小瓶内,然后加入 4 ml 消化液(分离成骨细胞的消化液:① A 液:含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O,用 100 ml 超纯水配制。②B 液(胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液):将 137 mg 胶原蛋白酶(Ⅰ 型,Worthington Biochemicals)和 50 mg 胰蛋白酶(Ⅲ,Sigma)溶入 10 ml A 液。调整 pH 至 7.2,然后用超纯水配成 100 ml。过滤除菌后,分装成 10 ml,在 -20℃ 条件下储藏)。加入的消化液应淹盖组织块。

    5. 在室温条件下,将含有组织块的液体搅拌 45 min。

    6. 弃去细胞悬液,因为这些细胞中很可能含有成纤维细胞。

    7. 加入 4 ml 消化液,在室温条件下搅拌 30 min。

    8. 收集消化液,在室温条件下离心(580 g,2 min)。

    9. 吸去上清液后,用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培养液混悬细胞,计数细胞。

    10. 将细胞悬液离心(580 g,10 min)后,用 4 ml 完全培养液混悬细胞。将此细胞悬液作为接种物。

    11. 将 75 cm2 培养瓶用 8 ml 完全 F12 培养液预孵育 20 min,以便用培养箱内的气体平衡培养液。

    12. 吸去预孵育培养液,然后加入 2 ml 完全F12培养液。

    13. 加入 4 ml 细胞悬液,接种密度为 6000~10000 个/cm2

    14. 最后加入 6 ml F12培养液,使总量成为 12 ml。

    15. 在分离细胞期间,向剩余的骨组织块加入 4 ml 消化液,重复消化 30 min 。

    收集分离下来的细胞。如有必要,重复消化几次。骨组织多时,消化时间可延长至 1~3 h 。每次消化后计数细胞,将分离的细胞分别接种于培养瓶。

    细胞传代

    1. 取出植入的组织块。

    2. 吸去培养液,用 D-PBSA (0.2 ml/cm2)浸洗细胞。

    3. 向培养瓶加入胰蛋白酶液(0.1 ml/cm2),在 37℃ 条件下孵育,直至细胞脱离瓶壁,且细胞彼此分离。用显微镜观察细胞的脱离和分离。一般孵育 10 min 即可。

    4. 将分离的细胞移入离心管,然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培养液。

    5. 离心(600 g,5 min)。

    6 . 吸去上清液,用完全培养液轻轻混悬细胞,反复吹打。

    7 . 留两份细胞份用于确定细胞密度,另一份用于 DNA 检测。

    8. 将剩余的细胞接种于先前用培养液平衡的培养瓶或培养皿。细胞可在 24 h 内贴壁。


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