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    成纤维细胞的分离方法

    发布时间: 2021-11-16  点击次数: 269次

    步骤

    1) 胚胎的分离。

    适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)

    a. 采用认可的方案处死啮齿动物。

    b. 立即在无菌超净台内用 70% 乙醇擦洗整个动物。若可能,置紫外灯下照射 5 分钟。

    c. 用无菌的镊了和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

    d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宮,置于无菌的培荞皿上。

    e. 剔除胚胎周围的包膜,将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的烧瓶中。

    f. 漂洗胚胎,去掉 PBS。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

    适用鸡胚胎

    a. 用 70% 乙醇擦洗鸡蛋壳。

    b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端,轻轻去除蛋壳露出气囊。

    c. 用无菌摄子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。

    d. 剪开包膜,用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎。

    e. 弃头部,将无头的胚胎置于广口烧杯中,用 PBS 漂洗。

    2) 将 6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯屮,用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎,

    用 PBS 漂洗。

    3) 在无菌状态下,将绞碎的胚胎转移于一 500 ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中,加人

    200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25% 的无菌胰蛋白酶(CIBCO/BRL)。

    4) 在温暖的环境中或置于 37°C 培养箱中轻轻搅动 15 分钟。

    5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降,将含冇悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中,该管内按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以灭活胰蛋白酶。

    6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的 500 ml 烧杯中,重复步骤 4 和 5。

    7) 离心混合的细胞悬液,1200r/min,5 分钟,弃上清。

    8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞,按步骤 7 再次离心。

    9) 用 PBS 反复洗涤细胞至上清清亮为止。

    即用含有 10% 牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再悬沉淀,并使终体积为 100 ml。

    11) 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。

    可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。

    12) 为确定现有细胞浓度,加人 0.2 ml 細胞悬液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解红细胞,用血细胞计数器进行细胞计数(见第 2 节中的"细胞计数")

    13) 按每 10 mm 平皿 1x107 至 4x107 细胞的数量接种于 10 ml 组织培养液中,在饱和湿度的 C02 培养箱中孵育直至细胞铺满。

    14) 当细胞长满后,去除培养液,用 10% 的温暖的 Versene(用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗涤细胞层 2 次。

    15) 弃 Versene,加人相同体积的温暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)

    16)37°C 孵育 5 分钟

    17) 用无菌吸管轻轻吹散细胞,并转移至一含 1~2 ml 牛血清的无菌管中。

    18) 离心,1200/min,5 分钟,弃上清。

    19) 再悬沉淀于 5 ml 培养液屮(见上文),另加人 15 ml 培养液,分装于 2 个 100 mm 平皿中。

    20) 置 37°C 饱和湿度的 C02 培养箱中培养细胞,直至细胞长满,继续步骤 14~20 以传代细胞。


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