销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 成年大鼠心室肌肉细胞的分离和培养实验方法步骤

    成年大鼠心室肌肉细胞的分离和培养实验方法步骤

    发布时间: 2021-11-16  点击次数: 296次

    材料与仪器


    KH 缓冲液 混合气体
    对流工作台或层流式超净台 乙(酉迷)罩 冷凝器 循环水浴和水浴摇床 圈型架 蠕动泵 台式医用离心机 无菌烧杯 ColorpHast pH 试纸

    步骤

    一、ARVM 细胞分离的准备工作

    1. 准备如下设备及器材:

    对流工作台或层流式超净台

    (酉迷)

    冷凝器

    循环水浴和水浴摇床

    带夹的圈型架

    免蠕动泵

    台式医用离心机

    95% O2 5% CO2 混合气体

    400 ml 无菌烧杯

    ColorpHast pH 试纸(精密型)

    2. 在对流式或层流式工作台中,装配 Langedorff 系统,把冷凝器和三通管夹着固定在圈型架上,管子接上蠕动泵。冷凝器连接 37℃ 循环水浴,这样温水从冷凝器底部流进从顶部流回水浴。

    3. 在工作台的无菌区域,布置下列无菌器械,这些可以是高压灭菌过的或一次性无菌器材:

    组织钳

    大号剪刀

    弯头小夹子 2 个

    小剪刀

    蚊式止血钳

    Swinnex 25 mm 规格的滤器支架

    250 ml 烧杯

    玻璃管和硅胶管

    带螺盖的,50 ml 锥形瓶,内加小搅拌棒

    带螺盖的 250 ml 锥形瓶

    一次性培养皿,吸管,60 ml 注射器,15 ml 和 50 ml 离心管,缝合线

    4. 准备加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit(KH)培养基,过滤除菌 37℃ 保温。

    5. 充氧饱和 KH 缓冲液和无钙 KH 培养基直到 pH 值约 7.4。转移 150 ml 氧饱和的无钙 KH 缓冲液至无菌的 250 ml 带螺帽锥形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽务必盖好。

    6. 制备酶溶液Ⅰ。装有氧饱和的无钙 KH 缓冲液的锥形瓶中加 75 mg 的胶原酶和 45 mg 的透明质酸酶。

    7. 制备酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ转移至一支新管中,加 2 ml 胰酶和 20 μl 无菌 1 mol/L CaCl2 过滤除菌。胶原酶/透明质酸酶溶液移至一无菌的 250 ml 的带螺帽锥形瓶中,胶原酶/透明质酸酶/胰酶液移至一无菌的 50 ml 带螺帽锥形瓶中。

    8. 往第一个 250 ml 烧杯中加 150 ml KH 缓冲液,并加入灌注系统,避免产生气泡。在插管处检查流过液的 pH 值,通以 95% O2/5%CO2 气体将 pH 值调回 7.4。流出液体回收到无菌 400 ml 烧杯中。

    9. 用预温的 KH 缓冲液覆盖整个平皿底。

    10. 把第一只鼠放进乙(酉迷)罩中麻醉。

    11. 把充过氧的无钙 KH 缓冲液放进第二只 250 ml 无菌烧杯中,将流速调高至 5.5 ml/min,灌注 6 分钟。

    12. 酶溶液Ⅰ放进第三只 250 ml 烧杯中,泵速度调节至 8 ml/min,灌注 5 分钟。把该 250 ml 烧杯放在心脏下面继续重新灌注心脏 15 分钟以上。

    二、解剖动物和灌注心脏

    1. 动物完全麻醉后,放在 Langendorff 装置的附近。动物平躺放置,用乙醇浸润胸部剪开胸部皮毛。

    2. 用大剪刀在肋骨下切一横向切口打开胸腔,然后切开胸膈膜。

    3. 提起剑突,胸中线两边约 2 cm 处沿肋骨各做一条径向切口,千万不要触及心脏。

    4. 用夹子掂起心脏,剪断下方的连接,摘下心脏和胸腺,摘下的心脏放在装有 KH 溶液的佩特里氏平皿,然后转到支着灌注设备的工作台上。

    5. 把心脏移到平皿的边缘,提起胸腺露出主动脉,用小剪刀剪掉胸腺。

    6. 打开泵,流速调至约每秒一滴。双手稳握两把小钳子,使主动脉沿插套滑动至插套管底部位于心脏的顶部。

    7. 用蚊式止血钳固定住心脏,钳子夹着主动脉底部并保证止血钳夹着主动脉上端。

    8. 在止血钳下部,用缝合线牢固地绑住心脏,灌注 3~5 分钟使心脏血完全排出。

    9. 从心脏上剔除残余组织,保持肺动脉以及动脉附属件的完整性。

    三、心脏组织的消化

    1. 酶溶液Ⅰ进行灌注的最后 2 分钟时,用 colorp Hast 试纸检查液体的 pH 值,若有必要,通气调节 pH 至 7.4。

    2. 从插套管上割下心室并仔细切成 1 mm2 的小块。转入装有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 锥形瓶中,于 37℃ 水浴,100 r/min 摇动孵育 15 分钟。

    3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述样品后转入一支 50 ml 锥形离心管中加 20 ml 洗涤培养基。

    4. 一支 60 ml 注射器,拿掉推杆,装上 Swinnex 滤器。往针筒内加入细胞悬液,把细胞过滤到一支新管中。

    5. 500 r/min(50 g)离心 30 秒,去上清后,细胞重新溶于 10 ml 新的洗涤培养基中。

    6. 让梭形细胞沉降 20 分钟,小心去上清,用 10 ml 新洗涤培养基重悬细胞。

    7. 让细胞沉降 15 分钟,去上清,用 10 ml 洗涤培养基重悬细胞。

    8. 重复上述洗涤步骤,共洗 4 次,最后一次洗涤后,倒去上清。加入 5 ml 洗涤培养基。

    9. 重悬细胞后小心铺放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上层,让梭形细胞沉降 10~15 分钟。

    10. 最后的细胞团应包含高比例的活的梭形心室心脏细胞。每只心脏若能收到 3X106 个细胞就很不错了。

    四、ARVM 细胞的培养

    1. 在上述细胞洗涤的同时,准备包被平板/盖玻片/载玻片于室温,用 10 μg/ml 层黏素溶液浸没 30 分钟。

    2. 加入适量的培养皿重悬最后所得的细胞团,并以每只 100 mm 规格平皿 1X106 个细胞的量接种至已包被过的平板上。

    3. 让细胞贴壁 1 小时,然后换新的培养基连续孵育。用加血清或不加血清的培养基继续培养 1 或 2 周。

    4. 细胞隔天换液。


在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]