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    从组织培养细胞中制备粗微体的方法

    发布时间: 2021-11-17  点击次数: 201次

    材料与仪器

    细胞
    环己酰亚胺 匀浆缓冲液
    培养皿

    步骤

    1. 培养基中加入环己酰亚胺(溶于蒸馏水,贮存液浓度 0.1 mol/L,-20℃ 保存。如果不溶,试着加热到 40℃ 以帮助溶解)(终浓度 10 μmol/L),37℃ 保温 5~10 分钟。

    2. 培养皿从 37℃ 转移到冷室,立即去掉培养基,用含有与培养基同样环己酰亚胺浓度的冰冷 PBS 洗涤细胞 3 次,将培养皿口朝下倒立于纸巾上数分钟,偶尔拍打。用 Kimwipe 纸巾擦掉侧壁上残留的 PBS。

    3. 加入 0.7 ml 含有 2~4 单位/ml RNase-IN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 的 HM,轻轻混旋培养皿以使 HM,能够覆盖培养皿的底面。

    匀浆缓冲液(HM):

    10 mmol/L HEPES-KOH 缓冲液,pH 7.5

    10 mmol/L KCl

    1 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L DTT

    0.5 mmol/L PMSF

    4. 将培养皿取一定的角度,在 HM 中打湿橡皮或塑料淀帚,按同一方向将细胞从培养皿的一边刮到另一边。

    5. 将刮取的细胞悬浮于 HM 中并集中到培养皿的一边,打湿细胞淀帚以同样的方法刮取培养皿其他部分的细胞,直到整个培养皿的细胞刮完(细胞刮走后培养皿的表面变得光滑)。用新鲜 HM 将玻璃吸管内表面打湿(见第 4 步),将细胞悬浮液转移到一个小的紧密配套的 Dounce 勻浆器中(Kontes)。

    6. 加 0.7 ml 新鲜 HM 到细胞已被刮掉的培养皿中,用细胞淀帚刮洗培养皿底部,将洗涤液转移到另一培养皿中,用同样的方法刮取细胞,将细胞悬浮液集中到 Dounce 匀浆器中。

    7. 当两到三个培养皿中的细胞悬浮液集中到一起以后,照下面的方法匀浆:

    (1) 以微小的角度握住 Dounce 匀浆器的管子立在桌子上。

    (2) 慢慢将玻璃研杵插入,直到研杵的头部与细胞悬浮液表面接触,沿管子的一边用力将研杵上下推动。

    (3) 重复步骤 (2),一上一下为一次共进行 15~20 次杵击。

    8. 细胞匀浆后立即用玻璃吸管将匀浆物转移到一个试管中,并与 1/10 体积的 2.5 mol/L 蔗糖混合。

    9. 重复 3~ 8 步,直到所有培养皿中的细胞被匀浆。

    10. 测量匀浆物的体积。

    11. 在 Sorvall HB-4 转头(700 g ) 中 2100 r/min 离心 3 分钟,增加速度到 6500 r/min(7000 g),再离心 10 分钟。

    12. 转移上清(PMS)到一个刻度量筒中并加 0.9 体积的 2.5 mol/L 蔗糖以得到终浓度力 1.33 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液,或者加 2.2 体积的 2.5 mol/L 蔗糖以得到终浓度为 1.8 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液。

    13. 在 SW41 转头离心管中准备下列分级梯度(从下到上):

    梯度 a:

    1.5 ml 1.8 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 单位/ml RNase-IN 的 1.5 moI/L 蔗糖-HM

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    梯度 b:

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 含 2~4 单位/ml RNase-IN 的 1.5 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 单位/ml RNase-IN 的 1.3 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    14. 在 SW41 转头中 4℃ 41000 r/min ( 最大 286500 g ) 离心 16 小时(梯度a ) 或离心至少 5 小时(梯度b)。

    15. 收集在 1.5 mol/L 和 1.8 mol/L 蔗糖层交界面形成的物质,这被认为是重粗微体部分。

    16. 根据实验目的用下列方法中的一种浓缩微体

    (1) 为了获得好的多聚核糖体分离图谱

    ① 用 0.1% SDS 溶液 100 倍稀释一部分微体,测量 260 nm 和 280 nm 的吸收值。

    ② 估计 100 μl 微体是否含有足够多的核糖体来展示多聚核糖体在蔗糖密度梯度中的分布图。

    ③ 用 HM 5 倍稀释样品或 7 倍稀释样品,并用 SW41 转头在蔗糖线性密度梯度中进行分析。

    (2) 为了收集沉淀

    ① 用 HM 3 倍稀释样品或 5 倍稀释样品。

    ② 根据样品的体积在 Beckman Ti60 或 Ti50 转头中 40000 r/min ( 最大 160000 g) 离心 60~80 分钟。

    (3) 为了用于体外翻译和重建实验

    ① 用含 RNase 抑制剂的 HM 3 倍稀释样品或 5 倍稀释样品。

    ② 将稀释的样品加到 1.8 mol/L 蔗糖垫层溶液上,在 SW41 或 SW60 转头(转头的选择取决于样品的体积)中 35000 r/min ( 最大 210000 g)离心 60 分钟。

    ③ 收集在垫层溶液上部形成的微体膜条带,如果有必要用 SW60 转头进一步浓缩到较小的体积中。


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