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    叶绿体分离的操作方法

    发布时间: 2021-11-17  点击次数: 690次

    材料与仪器

    叶子组织
    PBF-Percoll 溶液 山梨醇 BSA HEPES-KOH EDTA
    聚碳酸酯离心管

    步骤

    1. 制备 Percoll 梯度

    (1) 两个 50 ml 的聚碳酸酯离心管中分别加入 25 ml 50% 的 PBF-Percoll 溶液。

    50% PBF-Percoll

    0.33 mol/L 山梨醇

    50 mmol/L HEPES-KOH,pH 8.0

    2 mmol/L EDTA

    1 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L MnCI2

    50% Percoll (v/v)

    3% PEG 6000 (w/v)

    1% BSA ( 无脂肪酸,比如 Sigma 的 A7030)

    1% Ficoll (w/v)   

    (2) 29000 g(15600 r/min,SS34 转头;Sorvall)离心 15 分钟形成 Pencoll 梯度。

    形成的梯度可放 4℃ 过夜。

    2. 组织匀浆

    (1) 用剪刀收获叶子组织(照上述方法培养,一个平盘可得到大约 100 g 的叶组织),切成碎片,移至 1 L 的塑料烧杯中。

    (2) 加入冰冷的研磨悬浮缓冲液。在 4℃ 房间内,用 Polytron 匀浆器(带有 PTA-36/2 mol/L 发生器的 PTA 10/35 型)研磨叶子,每两到三个 5 秒脉冲为一循环,进行 6~7 次循环。

    研磨悬浮(GR)缓冲液:

    2 mmol/L EDTA 钠盐,pH 8.0

    1 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L MnCl2

    50 mmol/L HEPES-KOH,pH 8.0

    0.33 mol/L 山梨醇

    0.5 g/L BSA ( 无脂肪酸)

    5 mmol/L 抗坏血酸钠盐(用前添加)

    (3) 用两层米拉布(Calbiochem ) 过滤匀浆。将滤液倒入两个 250 ml 的离心瓶中。

    3. 2600 g(Sorvall GSA 转头 4000 r/min)离心匀浆 5 分钟。

    4. 小心倾去上清。加入 2 ml GR 缓冲液。用一小驼毛刷轻轻的将瓶子内壁的叶绿体刷松。置回转振荡器的冰上振动 5~10 分钟使团块散开。

    5. 将重悬浮的叶绿体加到 Percoll 梯度上。10500 g(Sorvall HB-4 转头的 8000 r/min)离心 10 分钟。

    6. 抽出梯度介质直到底部的条带。将每一管中叶绿体移至一 50 ml 离心管中,用 1x SH 稀释至 40 ml。2400 g 离心 2 分钟(SS34 转头,4500 r/min)。

    7. 用驼毛刷在少量 1x SH 中重悬浮沉淀。将所有叶绿体倒入一个离心管中,稀释至 40 ml,2400 g 离心 2 分钟。

    8. 在 1~2 ml 1 x SH 中重悬浮沉淀。

    9. 检测叶绿素确定叶绿体得率。

    (1) 将 5 μl 叶绿体悬液与 995 μl 80% 丙酮在一微量离心管中混匀。

    (2) 13000 g 离心 2 分钟。

    (3) 检测 663 nm 和 645 nm 处的光吸收值。

    (4) 叶绿素的量(mg/ml) = (8.02 A663 +  20.2 A645)/5

    10. 叶绿体在液氮中的长期保存。

    (1) 分离好叶绿体后,立刻用含 20% DMSO 的 1x SH 将最后的沉淀重悬至叶绿素浓度为 3~5 mg/ml。

    (2) 冰上放置 10 分钟。

    (3) 每 1 ml 为一份,用移液管吸至微量离心管中,快速冷冻,置液氮中保存。

    11. 冻存的完整叶绿体的复苏。

    (1) 室温融化冻存的叶绿体。用 1x SH 稀释至叶绿素浓度为 1 mg/ml。

    (2) 吸取 1~2 ml 含 35% Percoll 的 1x SH 缓冲液到一个 15 ml 的离心管中。其上加入融化的叶绿体。13000 g(Sorvall HB-4 转头,10000 r/min)离心 3 分钟。弃去上清,用 1x SH 洗沉淀。


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