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    如何从拟南芥菜中分离叶绿体?

    发布时间: 2021-11-17  点击次数: 230次

    材料与仪器

    叶组织
    研磨悬浮缓冲液
    烧杯 Polytron 匀浆器

    步骤

    1. 组织匀浆

    (1) 收集 10 g 叶组织,放进一 400 ml 的烧杯中。

    (2) 加入 200 ml 冰冷的研磨悬浮缓冲液。在 4℃ 的房间中,用 Polytron 匀浆器进行 6~7 个 3 秒钟脉冲匀浆叶组织。

    研磨重悬缓冲液:

    10 mmol/L EDTA

    50 mmol/L HEPES-KOH,pH 8.0

    0.33 mol/L 甘露醇

    0.5 g/L BSA ( 无脂肪酸)

    5 mmol/L 抗坏血酸盐(用前添加)

    (3) 用网层米拉布(Calbiochem) 过滤匀浆,滤液倒进 4 个 50 ml 离心管中。

    2. 匀浆在 8000 g(Sorvall HB-4 转头,7000 r/min)离心一分钟。

    3. 小心地倾去上清。加 1 ml 1x SH。用驼毛刷重新悬浮叶绿体,动作要轻。

    4. 吸 2 ml 含 35% Pecoll 的 1x SH 到一个 15 ml 的离心管中作为缓冲层:其上覆盖重悬浮的叶绿体。13000 g(Sorvall HB-4 转头,10000 r/min)离心 3 分钟。

    5. 弃去上清,沉淀用 15 ml 1x SH 洗两次,再用适当体积的 1x SH 重新悬浮。


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