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    如何从肝脏组织中制备细胞核?

    发布时间: 2021-11-17  点击次数: 343次

    材料与仪器

    大鼠
    裂解缓冲液 浓蔗糖溶液
    超速离心机 组织研磨器

    步骤

    1. 配制裂解缓冲液和浓蔗糖溶液(PMSF 在使用前添加),冰上放置。

    裂解缓冲液:

    0.25 mol/L 蔗糖网织红细胞标准缓冲液(RSB)

    0.25 mol/L 蔗糖(超级纯)

    10 mmol/ Tris-HCl (pH7.4)

    10 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L DTT

    0.5 mmol/L PMSF ( 用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加)

    浓蔗糖溶液:

    2 mol/L 蔗糖 RSB

    2 mol/L 蔗糖(超级纯)

    10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

    10 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L DTT

    0.5 mmol/L PMSF(用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加)

    2. 超速离心机(Beckman 的与 SW28 转头兼容型)和转头预冷到 4℃。

    3. 将组织研磨器(55 ml 的研磨腔; Thomas C 型腔和锯齿型 Teflon 研杵,3431-E25)。量筒和烧杯放到冰上。

    4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盘。

    5. 处死大鼠,取出肝脏,称重。

    6. 在一玻璃盘上,用剃刀片快速去除结缔组织,将 20 g 肝脏切成大约 1cm3 的小块。

    7. 将肝脏碎块装入含 40 ml ( 两倍体积)裂解缓冲液的冷的烧杯中。

    8. 将大约 30 ml 这种肝脏碎块和缓冲液混合物倒入预冷的组织研磨器腔中。

    9. 将研杵连到推进器,便其滑到研磨腔中,直到触到缓冲液面。然后握住研磨腔侧面,打开推进器。逐渐加大推进器速度直至其最高速度,同时稳定地将研磨腔沿转动的研磨向上推进。当研杵到达研磨腔底部时,向下拉研磨腔直到所有匀浆都从研杵旁通过,然后再将研磨腔沿研杵推回。重复该过程 5~10 次后关掉推进器。

    10. 检查细胞的裂解效率:

    (1) 将研磨腔放到冰上,取出 10 μl 裂解液,用 1 ml 裂解缓冲液稀释。

    (2) 取 2.7 μl 稀释后的裂解液加到载玻片上,再加上 2.7 μl 含 10 μg/ml Hoechst 染料(33258 10 mg/ml;Molecular Probes 或其他供应商)的裂解缓冲液,然后用一 18 mm2 的 1 号盖玻片将液滴盖上。

    (3) 比较亮的 DNA 染色的细胞核与同一视野的相图。

    (4) 如果裂解细胞数少于 95%,加大推进器速度,继续研磨样品 5~10 次。

    11. 在一漏斗中装入 4 层粗孔滤纸,放到一埋在冰浴中的量筒中,然后将匀浆倒进漏斗。

    12. 裂解剩余的肝脏碎块,匀浆通过滤纸过滤与其余裂解物样品混和,记录得到的裂解物体积。

    13. 将裂解物体积除以 6,再从离心管体积(35~38 ml) 中减去该体积。即可确定加入 6 个离心管中的浓蔗糖溶液的体积。在 2 mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至终浓度为 0.5 mmol/Lol/L。取适当体积(通常为 25~30 ml ) 加到离心管中,冰上放置。

    14. 向离心管中加入浓蔗糖溶液和等体积裂解物(通常 7~9 ml )。加裂解物时,应将移液管头靠在离心管内壁上部使裂解物缓慢流下,这样可减少裂解物与蔗糖溶液的混和。

    15. 将离心管放到预冷的转桶中,对面的转桶用裂解缓冲液平衡。

    16. 转桶在 SW28 转头上装好,放进预冷的离心机中,23000 g,4℃ 离心 30 分钟。

    17. 吸出裂解物和蔗糖溶液,或者在一烧杯上将离心管倒转将液体倒出。用一无绒纸巾清除内壁上的残余物质,离心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解缓冲液重新悬浮沉淀。

    18. 将沉淀的重悬浮液集中到一个 50 ml 的离心管(锥形或圆形底)中,加裂解缓冲液至 50 ml 终体积,在医用离心管中 1500 g 离心 5 分钟。

    19. 吸出上清,细胞核沉淀重悬浮于 1 ml 的裂解缓冲液中。取出少量样品稀释 100 倍后在血球计数板上计数细胞核数目。

    20. 用裂解缓冲液将样品稀释到期望浓度的两倍,加入等体积甘油,放液氮中冷冻,-80℃ 保存。


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