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    从培养的细胞中纯化总RNA的方法

    发布时间: 2021-11-24  点击次数: 265次

    材料与仪器

    细胞
    RNA 提取缓冲液 变性液 水饱和酚
    培养皿 Falcon 2063 管

    步骤

    1. 取 1 个细胞已长满的 100 ml 培养皿,吸出培养液,加 2 ml RNA 提取缓冲液,用橡胶刮棒刮下细胞。

    RNA 提取缓冲液:

    变性液,20 ml

    β-巯基乙醇,0.144 ml

    2 mol/L 乙酸钠,pH 4,2 ml

    水饱和酚,22 ml    

    可避光保存在 4℃ 2~3 个月。

    变性液:

    4 mol/L 硫氰酸胍:250 g 硫氰酸胍

    25 mmol/L 柠檬酸钠:17.6 ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠,pH 7

    0.5% 十二烷基肌氨酸钠(Sarkoayl):26.4 ml 10% 十二烷基肌氨酸钠,293 ml H2O

    混合各组分,在 65℃ 搅拌溶解。可以在室温保存 3 个月。

    水饱和酚:

    用在水浴中加热到 65℃ 的灭菌水来溶解酚。从水浴取出后使冷却到 4℃。加足量水以维持水相(上相)。可在 4℃ 避光保存 2~3 个月。

    2. 细胞裂解物转移到一个 Falcon 2063 管中,加 200 μl 氯仿,混合均匀。

    3. 细胞冰浴 15 分钟。

    4. 细胞裂解物在 4℃ 以 5000 g 离心 30 分钟。

    5. 转移水(上)相,注意不要搅动交界面,水相放到一个干净的 Falcon 2063 管中并加入 1 ml 异丙醇(仅用于 RNA 工作的溶液)。

    6. 管子在  -20℃ 放至少 1 小时或过夜。

    7. 用固定角度的转头在 4℃ 以 8000 g 离心 30 分钟沉淀 RNA,小心去掉上清。

    8. 加 1 ml 70% 乙醇洗白色沉淀物并在以 8000 g 离心 15 分钟。洗 3 次,不要振摇。

    9. 最后一次 70% 乙醇洗涤后,去掉乙醇并稍稍离心管子收集残液。吸掉剩下的乙醇。

    10. 短时间干燥沉淀。空气干燥约 30 分钟或在真空干燥器中 2~3 分钟。

    11. 用 50~100 μl DEPC 处理过的水重悬 RNA,测量 1:100 稀释的样品的光密度(OD260)来计算浓度。

    浓度(μg/ml)=(稀释度)[(40 μg/ml·OD260)](样品的 OD260

    12. 重悬的 RNA 贮存在 -70℃。


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