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细胞匀浆的操作
发布时间： 2021-11-24 点击次数： 2662次材料与仪器
细胞
缓冲盐溶液 二异丙基氟瞬酸 匀浆缓冲液
相差显微镜步骤
1. 准备下面的贮液和材料。
等渗的缓冲盐溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO4，pH 7.2)
二异丙基氟瞬酸（DIFP）
1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0
0.5 mmol/L K+EGTA，pH 7.0
0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0
0.1 mol/L DTT
NaN3
蛋白酶抑制剂
PMSF
抑胃酶肽 A
亮抑酶肽
刀豆胰蛋白酶抑制剂
匀浆缓冲液：
0.34 mol/L 蔗糖
20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0
5 mmoI/L K+EGTA，pH 7.0
5 mmol/L K+ATP，pH 7.0
5 mmol/L DTT ( 干粉或用贮存液）
50 μmol/L PMSF
3 mmol/L NaN3
22 μmol/L 抑胃酶肽 A
1.2 μmol/L 亮抑酶酞
10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制剂
PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更稳定，但更贵。
2. 洗细胞：轻轻地沉降细胞（例如 3000 g 离心 5 分钟），去掉培养基，通过振摇打碎沉淀物，然后重悬于至少 10 倍体积冰冷的等渗缓冲盐水中。再次在新鲜的等渗缓冲盐水中沉降和重悬，总共 3 次。对于不同的细胞类型，离心力和时间应该进行优化。
3. 最终的冰冷的细胞悬液中补加 DIFP，使终浓度为 5.7 mmol/L（每毫升细胞悬液中加 1 μl）。冰浴 5 分钟。
4. 上述的步骤 2 沉降细胞，然后重悬于 4~6 倍匀浆缓冲液中。
5. 细胞匀浆要造成最大破坏，但要尽量减少氧化。
6. 用相差显微镜检测细胞的裂解，证实超过 99% 都已经裂解了。- 下一篇：如何做非肌肉肌球蛋白的层析纯化？
- 上一篇：从培养的细胞中纯化总RNA的方法
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