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    细胞匀浆的操作

    发布时间: 2021-11-24  点击次数: 1033次

    材料与仪器

    细胞
    缓冲盐溶液 二异丙基氟瞬酸 匀浆缓冲液
    相差显微镜

    步骤

    1. 准备下面的贮液和材料。

    等渗的缓冲盐溶液(例如 PBS,150 mmol/L NaCl;10 mmol/L NaPO4,pH 7.2)

    二异丙基氟瞬酸(DIFP)

    1 mol/L 咪唑-HCl,pH 7.0

    0.5 mmol/L K+EGTA,pH 7.0

    0.1 mol/L K+ATP,pH 7.0

    0.1 mol/L DTT

    NaN3

    蛋白酶抑制剂

    PMSF

    抑胃酶肽 A

    亮抑酶肽

    刀豆胰蛋白酶抑制剂

    匀浆缓冲液:

    0.34 mol/L 蔗糖

    20 mmol/L 咪唑-HCl,pH 7.0

    5 mmoI/L K+EGTA,pH 7.0

    5 mmol/L K+ATP,pH 7.0

    5 mmol/L DTT ( 干粉或用贮存液)

    50 μmol/L PMSF

    3 mmol/L NaN3

    22 μmol/L 抑胃酶肽 A

    1.2 μmol/L 亮抑酶酞

    10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制剂

    PMSF 可以用 pAPMSF 代替,它更稳定,但更贵。

    2. 洗细胞:轻轻地沉降细胞(例如 3000 g 离心 5 分钟),去掉培养基,通过振摇打碎沉淀物,然后重悬于至少 10 倍体积冰冷的等渗缓冲盐水中。再次在新鲜的等渗缓冲盐水中沉降和重悬,总共 3 次。对于不同的细胞类型,离心力和时间应该进行优化。

    3. 最终的冰冷的细胞悬液中补加 DIFP,使终浓度为 5.7 mmol/L(每毫升细胞悬液中加 1 μl)。冰浴 5 分钟。

    4. 上述的步骤 2 沉降细胞,然后重悬于 4~6 倍匀浆缓冲液中。

    5. 细胞匀浆要造成最大破坏,但要尽量减少氧化。

    6. 用相差显微镜检测细胞的裂解,证实超过 99% 都已经裂解了。


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