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    如何做非肌肉肌球蛋白的层析纯化?

    发布时间: 2021-11-24  点击次数: 166次

    材料与仪器

    非肌肉肌球蛋白
    匀浆缓冲液 肌动蛋白聚合缓冲液 凝胶过滤 羟基磷灰石缓冲液 GF HT 缓冲液
    大容量转头

    步骤

    高速离心和 DEAE 层析

    1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制剂的匀浆缓冲液平衡 DEAE 纤维素,取 50 ml 装到 2.5cm x 35cm 有合适管路的柱子上。

    2. 准备总体积为 0.8 L,线性梯度为 0~0.5 mol/L KCl 的匀浆缓冲液。

    3. 用大容量转头(例如 Ti 647.5,它带 6 个 70 ml 容量的聚碳酸酯桶)以 43000 r/min,137600 g 超速离心 2 小时,从已匀浆的细胞中沉淀细胞碎片。

    4. 尽可能多地转移清亮的上清,不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪残渣。

    5. 混合 100 ml 上清和 100 mI DEAE-纤维素(已如上所述用匀浆缓冲液预先平衡)可以一次性地把清亮的上清样到 DEAE 上。DEAE-蛋白混合物倒进 2.5cm x  35cm 的预先装了 50 ml 用匀浆缓冲液和 PMSF平衡的 DEAE-纤维素的柱子。

    6. 立即开始分部收集(每管 8.5 ml )。

    7. 用 3~5 倍体积的匀浆缓冲液洗柱子,用 0.8~1 升 KCl 梯度为 0~0.5 mol/L 的匀浆缓冲液进行洗脱。

    8. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性(K+EDTA 或 Ca2+ 活性峰)、SDS-PAGE、免疫印迹、ELASA 或放射标记及固相结合分析.

    9. 把从 DEAE 层析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。

    非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌动蛋白共沉淀

    10. 准备下列贮存液。

    1 mol/L KCl

    0.1 mol/L MgCl2

    溶于不含 ATP 的肌动蛋白聚合缓冲液的 30% 蔗糖垫层:

    300 mg/ml 蔗糖

    50 mmol/L KCl

    2 mmol/L MgCl2

    10 mmol/L 嘧唑-HCl,pH 7.0

    11. 计算所需的外源肌动蛋白量,使混合的 DEAE 收集液中肌动蛋白的终浓度为 0.125 mg/ml。所需肌动蛋白体积(ml)由下式给出:

    VA= ( 0.125 x Vpool)/ [ ( 肌动蛋白)-0.125]

    ( 肌动蛋白)是在缓冲液 A 中 G-肌动蛋白贮存液的浓度,单位 mg/ml。

    12. 量出所需 G-肌动蛋白的量(使用 1~8 mg/ml 溶于缓冲液 A 中的肌动蛋白,用肌动蛋白制备中所述的方法获得),并通过和适当体积的 50x 肌动蛋白聚合缓冲液(所加的体积=VA/50)混合并在室温培养 10~20 分钟来使它聚合。

    50x 肌动蛋白聚合缓冲液:

    2.5 mol/L KCl

    1 mol/L MgCl2

    3 mmol/L NaN3

    13. F-肌动蛋白和 DEAE 收集液混合(步骤 9 ),使 MgCl2 浓度为 2 mmol/L。

    14. 加入足量的 1 mol/L 葡萄糖使终浓度为 50 mmol/L ( 加 50 μl/ml ),然后加己糖激酶使终浓度为 1 单位/ml(0.25 μl/ml)。室温下搅拌 5 分钟,然后转移到 0℃ 过夜(几小时可能就足够了)。

    15. 在超速离心管中装 1/3 溶于不含 ATP 的肌动蛋白聚合缓冲液的 30% 蔗糖垫层,把含僵硬的肌动球蛋白复合物的样品铺到垫层上面。离心 3 小时沉淀肌动球蛋白。

    通过不连续凝胶过滤从外源肌动蛋白中分离肌球蛋白

    16. 准备用于凝胶过滤的贮存液和材料

    4x 凝胶过滤/羟基磷灰石缓冲液:

    200 mmol/L 咪唑-HCl,pH 7.0

    20% 蔗糖

    8 mmoI/L K+EDTA,pH 7.0

    12 mmol/L NaN3

    可以贮存在 4℃。

    2x GF/HT 缓冲液:

    4X GF/HT 缓冲液,100 ml

    0.1 mol/L K+ATP,pH 7.0,10 ml   

    DTT,62 mg

    用 dH2O 加到 200 ml 。

    KI 凝胶过滤缓冲液:

    2x GF/HT 缓冲液,20 ml

    Kl,4.78 g

    用 dH2O 加到 40 ml。

    KCl 凝胶过滤缓冲液:

    2x CF/HT 缓冲液,180 ml

    KCl,16.10 g

    用 dH2O 加到 360 ml。

    17. 备一个 1.5 x 85 cm 的用 KCl 凝胶过滤/羟基磷灰石缓冲液平衡了的 A15-m 琼脂糖凝胶过滤柱。

    18. 离心步骤结束的时候,在凝胶过滤柱上加 12~19 ml KI 缓冲液。

    19. 倒掉上清和蔗糖,留下肌动球蛋白沉淀物,然后在冰库中把管子倒转在纸巾上 5~10 分钟,小心地使液体流干。用棉签去掉多余的液体。

    20. 处理沉淀:

    (1) 用不锈钢刮刀挖出沉淀。

    (2) 在 4.3 ml KI 缓冲液中用一个 7 ml 的带紧的研杵的 Dounce 匀浆器进行匀浆。

    (3) 超速离心(50Ti 转头,30000 r/min 63400 g)30 分钟使样品变清。

    (4) 仔细地转移上清,不要带任何沉淀碎片。

    (5) 立即把样品加到凝胶过滤柱上并用 KCI 凝胶过滤缓冲液跑柱子。

    21. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性、SDS-PAGE、免疫印迹、ELASA 或放射标记及固相结合分析。混合含肌球蛋白的收集液。洗脱天然肌球蛋白-II 的分配系数应该是 0.13~0.14。

    羟基磷灰石层析

    22. 准备进行羟基磷灰石层析的贮存液和材料。

    预先在 GF/HF 缓冲液中平衡了的羟基磷灰石(2~4 ml)

    线性梯度,总体积 20~40 ml 的 GF/HF 缓冲液,0~300 mmol/L K+PO4,pH 7.0

    0.6 mol/L K+PO4,pH 7.0

    23. 准备一个 1x 5 cm 的有合适管路的柱子。

    24. 对收集液的进一步纯化是重复肌动蛋白亲和及凝胶过滤步骤或接着用经基磷灰石层析。

    25. 收集液和预先平衡好的羟基磷灰石(每毫升羟基磷灰石 12~20 ml 收集液)混合在一起,然后旋转培养过夜(短一点时间可能也够)。

    26. 把蛋白/羟基磷灰石混合物倒到一个小柱子(1x5 cm) 中,用 5~10 倍体积的 CF/HF 缓冲液洗,然后用总体积 20~40 ml 的 GF/HF 缓冲液,0~300 mmol/L K+PO4 线性梯度,pH 7.0 洗脱。肌球蛋白Ⅱ在大约 200~220 mmol/L K+PO4,pH 7.0 处洗脱下来。


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