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    大鼠乳鼠成骨细胞培养实验——酶消化法

    发布时间: 2021-12-05  点击次数: 230次

    材料与仪器

    SD大鼠
    F12 完全培养液 胰蛋白酶 Ⅱ型胶原酶 酒精
    手术器械 磁力搅拌器

    步骤

    一、实验步骤


    1.  拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出头盖骨,分离顶骨和额骨,冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血,放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤, 将颅骨剪成2~5 mm2 碎片,将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min,以清除纤维组织细胞,弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。

    2.  然后以0.1%  Ⅱ型胶原酶10 ml,在37℃环境中消化 20 分钟,室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟,收集消化液,室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞,接种于75 ml 培养瓶中,补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml;对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟,将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱,在5% CO2,95%空气,37℃温度下培养,24 小时后可见细胞贴壁生长,胞质开始伸展,换新鲜培养液,以后每隔48 小时换培养液(注:消化视具体情况而定,也可多消化 1 遍)。

    3.  原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时,取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶,弃去培养 液,传代时先以 PBS 冲洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室温下消化3~5 分钟,将胰蛋白酶液弃去,加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并,计数;用 F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多,细胞老化或者分化明显。
     
    二、结果

    如图所示,成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似,但是不同的是,比成纤维细胞更不容易消化,尤 其是传代次数多,细胞老化的时候,非常难消化,并且不易消化成单个细胞。
     
    图1:成骨细胞

    图2:成骨细胞100倍
     

    图3:成骨细胞形成的矿化结节
    三、鉴定的方法

    1.  碱性磷酸酶(ALP)活性检测

    2.  骨玻璃样蛋白(BGP)检测

    3.  矿化结节检测


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