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    细胞冻存的方法和注意事项

    发布时间: 2021-12-08  点击次数: 538次
    实验室里有细胞未用到时,需要将细胞冻存,那细胞冻存应怎么做呢?和细胞冻存时需要注意哪些问题,本期和大家分享细胞冻存的方法和需注意的事项。

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    1、冷冻培养基为什么要加DMSO?

    因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时,细胞内外的水分都会很快形成冰晶,冰晶的形成将造成细胞损伤,还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高包膜对水的通透性。


    2、DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?

    冷冻保存使用的 DMSO 等级,必须为 Tissue culture grade 的 DMSO,其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 4 ℃,避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO,则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。


    3、欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

    冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。


    4、冷冻保存细胞的方法?

    冷冻保存方法一:冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。

    冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中,存活率稍微降低一些。


    5、细胞冻存太多会不会浪费?

    每一种细胞系都应有充足的冻存储备,防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种,而且每一批次培养的细胞状态都不同,应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多,造成细胞衰老或者发生改变。



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