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    CAT活性的相-抽提分析法

    发布时间: 2021-12-16  点击次数: 388次

    材料与仪器

    转染细胞
    氯霉素 Tris·Cl TMPD 二甲苯
    离心机 离心管 培养箱

    步骤

    一、来源于哺乳动物细胞

    1.  按“CAT活性的层析分析法"中的步骤1~5的冻融法,制备哺乳动物细胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制细胞方法来收集细胞,则将原位裂解法的步骤1至4用以下的步骤2至4代替。

     
    2.  室温下,300 g 离心5 min,弃去上清。每107细胞加入1 ml 低渗缓冲液,离心,弃上清。然后每107细胞加Triton裂解液200 μl。

    二、来源于植物原生质体
     
    1.  室温下,2 000~4 000 g 离心5 min,将植物原生质体细胞收集于1.5 ml 的微量离心管中,弃去上清。

    2.  往细胞沉淀加50 μl 低渗缓冲液,在旋涡混合器上剧烈振荡,将离心管置于-70℃ 15 min以上,或置于干冰/乙醇浴中5 min 以冻结样品。融解样品,在室温下13 000  g 离心2 min,将上清移入一个干净管中。

    3.  对于分析50 μl 细胞提取液,配置如下CAT分析混合液
    20 μl  0.01 μCi/μl [3H]氯霉素
    5 μl  5 mg/ml 丁酰辅(酶)A
    5 μl  2 mol/l Tris·Cl,pH8.0
    20 μl  H2O
     
    4.  对每组分析,将50 μl CAT分析混合液加入50 μl 细胞提取液中。37℃温育30~90 min。
     
    5.  用200 μl 2:1的TMPD/二甲苯剧烈报荡提取乙酰化的氯霉素,离心并移出上层液相至一只闪烁瓶中。

    6.  样品中加3~5 ml 闪烁液,计数测定CAT的活性。


    同实验其他方法

    CAT活性的层析分析法

    1.  100 mm 培养皿中的转染了CAT表达质粒的贴壁细胞,用PBS洗两次,每次5 ml每培养皿加入1 ml TEN溶液。将细胞置于冰浴5 min。   2.  用橡胶

    原位裂解细胞的CAT分析法

    1.  60 mm 培养皿中转染了CAT表达质粒的细胞,用2 ml PBS洗1次。每培养皿加入2 ml 低渗缓冲液,在室温下温育2~5 min。 2.  吸去低渗缓冲液,加入400 μl T

    人生长激素的放射免疫分析法

    1.  取转染了hGH表达质粒的哺乳动物细胞的培养液100~500 μl。 2.  加100 μl 培养液或标准品至12 mm×75 mm 圆底试管中。加入100 μl 125I-

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