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    从96孔微培养板生长的哺乳动物细胞中分离DNA

    发布时间: 2021-12-20  点击次数: 122次

    原理

    本方案由 Ramirez-solis 等的方法 1992,1993 改进而成,是一种从微培养板的每个孔生长的真核细胞抽提基因组 DNA 的简便有效的方法。每个孔产生的基因组 DNA 足以做数次聚合酶链反应(PCR) 或者一次 Southern 杂交。对于制备用于 PCR 反应的基因组 DNA 的最佳方法。

    材料与仪器

    限制性内切核酸酶 无 DNase 的 RNase 细胞
    细胞裂解缓冲液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸盐缓冲液 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE
    抽气设备 多通道移液器 温箱 振摇平台 Tupperware 容器

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液和溶液

    细胞裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),10 mmol/L NaCl,0.5% (m/V) Sarkosyl)

    乙醇

    NaCl/乙醇溶液

    磷酸盐缓冲液(PBS )

    蔗糖凝胶上样缓冲液

    TE (pH 8.0)

    2. 酶和缓冲液

    限制性内切核酸酶

    无 DNase 的 RNase

    3. 专用设备

    与带阀门的真空管相连的抽气设备

    多通道移液器,8 或 12 道

    温箱,预设至 60℃。

    振摇平台

    Tupperware 容器

    4. 细胞和组织

    在 96 孔微培养板上生长的细胞

    二、方法

    1. 用蓝色尖头或者巴斯德移液管吸去 96 孔培养板每个培养孔中的培养液。

    只要小心不接触细胞层,通常不用毎个培养孔换新的尖头。

    2. 每个培养孔中的细胞用 100 μl 磷酸盐缓冲液冲洗 2 次。

    3. 用多通道移液器在微培养板的每个孔中加入 50 μl 细胞裂解液。将数张湿的吸水纸置入一个聚丙烯盒中(如 Tupperware 盒),再将盛有细胞裂解液和细胞的微培养板放在吸水纸上,用盖封严盒子。

    4. 将封好的盒子在 60℃ 温箱中温育 12~16 h。

    5. 将盒子移出温箱,取出培养板平放在工作台上,冷却数分钟,每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混匀,直接将培养板于室温温育 30 min。温育末期应见到纤维状的核酸沉淀。

    6. 缓慢地倒转培养板,将乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀应黏附在培养孔的底部。将每个培养板倒置于干燥的吸水纸上,使残余乙醇从培养板流出。

    7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇,小心不要移动核酸沉淀。按步骤 6 倒转培养板以去除 70% 乙醇。在吸水纸吸去多余的液体。用 70% 乙醇再冲洗沉淀 2 次。

    8. 使培养板在室温干燥直至最后的乙醇挥发。如果基因组 DNA 将用于 PCR 分析,进行步骤 9。如果 DNA 将用于 Southern 杂交,进行步骤 10、11 和 12。

    9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室温缓和地震摇 12~16 h 使 DNA 溶解。

    10. 如果 DNA 将用于 Southern 杂交,制备下列限制性内切核酸酶混合物;每孔需 40 μl。

    H2O                                      0.8倍体积

    10X限制性内切核酸酶缓冲液   0.1倍体积

    无 DNase 的 RNase               10 μg/ml

    使用前每 40 μl 混合物加入 10 个单位限制性内切核酸酶。

    11. 用多通道移液器在每个孔中加入 40 μl 限制性内切核酸酶反应混合物。反复抽吸数次使孔中内容物混合,小心避免产生气泡。按步骤 3 用 Tupperware 容器制作湿盒, 将培养板放入,使反应在适宜的消化温度温育 12~16 h。

    12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液终止反应,进行 Southern 印迹和杂交以分析消化的 DNA。

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