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    293T细胞怎样才能养得好?

    发布时间: 2022-02-28  点击次数: 772次
     名称
     293T [HEK-293T] (人胚肾细胞) 
     形态
     上皮样
     致瘤性
     +
     产物或抗原
     大T抗原
     生长特性
     贴壁细胞
     营养体系
     DMEM+10%FBS

    图片


    来源:ATCC


    293 [HEK-293]细胞是经人腺病毒5(Ad5)转染而形成的人胚肾细胞永生化细胞系,293细胞包含并表达转染的Ad5基因。


    293T细胞是293 [HEK-293]细胞株插入了SV40 T-antigen的温度敏感基因形成的高转衍生株,广泛用于病毒包装。其有多种衍生株,比如HEK293,293T/17等,来源都是人胚胎肾细胞,其极少表达细胞外配体所需的内生受体,且比较容易转染,是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。


    293T细胞广泛应用于病毒包装,用磷酸钙转染效率可高达50%。蛋白表达水平高,转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜上)蛋白的便捷方式。




    细 胞 特 性  


    1. 贴壁性差

      对贴壁因子很有要求,最好进行包被;也可以提高血清比例来尝试观察一下;注意板材的亲水性,细胞贴壁疏松,可只用EDTA消化,不要用胰蛋白酶过度消化。


    2. 增殖迅速

      细胞增殖非常快,通常倍增时间不到一天,隔天即可长满,融合率不可过高,需要及时传代。


    培 养 难 点  


     细 胞 聚 团 严 重 

    1. 为啥293T细胞传代后聚团严重?

    图片

    经传代后严重聚团的293T细胞

    图片来源于客户仅供参考


    原因推断:胰酶消化操作不当导致细胞聚团。

    • 消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重,破损的细胞碎片容易粘连聚团。

    • 消化时细胞融合率太高,成片脱落,将不容易被吹散,容易聚团。


    解决办法:鉴于该细胞贴壁疏松,普通0.25%胰酶消化时间控制15s-30s;吹打动作轻柔,控制在10-20次;细胞融合率达到80%传代即可传代,不可长的太满。


    2. 为啥293T换了血清批次后聚团严重?

    图片

    换血清批次后严重聚团的293T细胞

    图片来源于客户仅供参考


    原因推断:血清来源于动物,其组成成分有1000种左右,且血清组成及含量常随供血动物的年龄、生理条件和营养条件而异。每个批号的组分百分比含量都是不固定的,所以批间差异是存在的。293T细胞本身有聚团生长特性,但严重聚团可能受到血清里的某些因子刺激。


    解决办法:先用血清试用装,试用效果好,可购买和血清试用装批次相同的正装,囤积半年或一年的用量,有效避免批间差对细胞的影响(胎牛血清在-20℃保存可达5年)。


     贴 壁 性 差 

    1. 为什么用了新批号的血清,293T细胞贴壁性变差?

    图片

    贴壁疏松的293T细胞

    图片来源于客户仅供参考


    原因推断:血清存在批间差异,而293T细胞本身特点就是贴壁性差,对不同批次的血清适应性不同,就容易出现贴壁疏松现象。


    解决办法:可适当加高血清比例(最高不超过20%);建议试好一个血清批次多囤一些,可以避免血清批间差对细胞的影响。


    2. 为啥293T细胞从瓶里(例如T25)铺板到孔里(96孔板),贴壁性变差?

    原因推断:排除掉瓶和孔板本身材质或TC(亲水处理)处理因素外,293T细胞贴壁性变差极有可能是因为空间的隔离导致细胞自分泌或旁分泌产生的信号分子浓度太低,不利于细胞的贴壁或增殖。


    解决办法:在铺板前,对孔板进行明胶包被,可有效促进细胞贴壁。


     转 染 病 毒 后 细 胞 凋 亡 严 重 

    1. 为啥293T细胞转染病毒后凋亡严重?

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    经病毒转染后漂浮凋亡的293T细胞

    图片来源于客户仅供参考


    原因推断:在排查了方法步骤和转染试剂,依然没有改善的情况下,可排查一下转染前的营养体系,尤其是血清批间差带来的影响。很多同学说前期培养细胞形态正常呀,其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标,还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定(比如倍增时间,存活率)。


    解决办法:通过更换血清批次,再进行转染实验并观察转染后的效果,比较分析出原因。


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