您的细胞准备好“开学”了吗？

01

1. 将水浴锅提前预热至37℃

2. 细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

02

1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

03

1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2. 约1-2min后冻存管内液体*溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

04

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

05

1. 吸弃上清液。

2. 向离心管内加入10ml*培养液，吹打制成细胞悬液。

3. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

06

细胞浓度以5×105/ml为宜。

07

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO₂的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

08

1. 注意无菌操作。
2. 取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜。
3. ☆此项尤为重要，如果冻存管密封不严，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时，在水浴中摇晃，冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸，所以，一定要戴保护眼镜和手套。
4. 应在1-2min内使冻存液*融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
5. 细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅中进行解冻。
6. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少其对细胞的损伤。
7. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，经验总结，培养基越少细胞越容易贴附。
8. 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
9. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少，DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1％。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。  

结果分析

判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。