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    您的细胞准备好“开学”了吗?

    发布时间: 2022-02-28  点击次数: 244次
    各位老师在进行细胞培养时,肯定会遇到以下问题:
    • 细胞越长越多
    • 买的细胞比较贵重
    • 节假日无法照看细胞
    • 实验不顺畅需要重新进行实验


    这时,我们就需要适当的保存一些细胞,也就是冻存细胞


    细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

    利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。

    在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。



    如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。


    放假前大家进行细胞冻存,安心过个好年,那么接下来


    您的细胞准备好“开学"了吗?


    细胞冻存复苏遵循的原则是:慢冻快融


    今天我们来聊聊,细胞复苏时需要注意的那些事儿。
    细胞复苏的原则:快速融化
    必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。


    01

    实验前准备


    1. 将水浴锅提前预热至37℃

    2. 细胞实验室进行常规消毒,用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面,保证无菌。

    3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

    02

    取出冻存管

    1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

    2. 从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

    03

    迅速解冻

    1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。

    2. 约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

    04

    平衡离心

    用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

    05

    制备细胞悬液

    1. 吸弃上清液。

    2. 向离心管内加入10ml完全培养液,吹打制成细胞悬液。

    3. 用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,放入培养箱中培养。

    06

    细胞计数

    细胞浓度以5×105/ml为宜。

    07

    培养细胞

    将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养,换液的时间根据细胞情况而定。

    08

    记录复苏日期


    “ Note

    注意事项



    细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出现问题的部分,因此我们帮您总结以下几点注意事项,帮助您更好的进行实验操作:

    1. 注意无菌操作。
    2. 取细胞的过程中可能会接触液氮,一定注意带好防冻手套,护目镜。
    3. ☆此项尤为重要,如果冻存管密封不严,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时,在水浴中摇晃,冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸,所以,一定要戴保护眼镜和手套。
    4. 应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢,则会造成细胞损伤。另外,细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行,以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
    5. 细胞复苏过程中,升温的速率要大,把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅中进行解冻。
    6. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少其对细胞的损伤。
    7. 细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15ml培养液,经验总结,培养基越少细胞越容易贴附。
    8. 复苏细胞分装的问题:复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
    9. 加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果加培养基的太少,DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1%。所以如果冻存液的浓度是10%DMSO,那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。  


     初学者易犯错误 

    1. 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。
    2. 水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。
    3. 离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。
    4. 一次复苏细胞种类过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。


    解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的,并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清,会造成细胞生长不良,甚至死亡,像水土不服一样。


    结果分析


    判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。


    如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。


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