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    实用操作RAW264.7细胞传代处理

    发布时间: 2022-02-28  点击次数: 393次

    一.RAW264.7细胞背景介绍

    细胞取材于Abelson小鼠白血病病毒诱发的肿瘤组织,是科研上尤为常用的炎症细胞模型之一。该细胞易于增殖,有高效DNA转染力,对RNA干扰敏感,常用作转染宿主细胞和复制小鼠诺如病毒。细胞有sIg-、Ia-、Thy-1.2抗原阴性。据报道,该细胞建系后已不分泌且检测不到病毒颗粒,XC斑点形成实验阴性。可以抗体依赖性地分解绵羊红血球与肿瘤靶细胞,LPS或PPD处理2天后可诱导分解红血球但对肿瘤靶细胞无作用。

     

     

    细胞株

     

    二.RAW264.7细胞形态特征

    1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形,细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。贴壁特别牢固。若细胞呈多角形时,细胞为激活状态。

    2、RAW264.7具有吞噬能力,当细胞吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。若细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣,细胞刚传完代比较稀疏的时候,都会让该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形细胞。

    3、这个细胞属于慢热型的,很难消化,消化时间不够则导致细胞无法消化下来,消化时间太长,传代之后就会长个角给你看看,使劲吹打和细胞刀刮下来,则传代之后不只是长个角给您看看了,还会飘起很多小黑点,而且这种细胞传代时接种密度要大,否则也容易使巨噬细胞分化,细胞变形,并且不能恢复,这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

    4、RAW264.7细胞生长时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长,片片之间不连接,等到长到更多更密的时候会连成大片,并叠加成层。叠加成层的细胞需要更多的营养,一旦营养跟不上,细胞也会长个角给你瞅瞅,所以需要在细胞叠加的时候进行操作。

    5、RAW264.7细胞传代后贴壁迅速,半小时就能贴上一大片,刚贴壁是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。若这个时候觉得活化的细胞较多,即长梭形的细胞较多时,可在细胞传代消化重新贴壁半小时后进行换液,只保留生长状况较好的细胞。

    6、RAW264.7细胞的生长对血清要求比较高,血清不好会导致细胞生长情况变差。这是一个大胃王,所以在看到培养基变黄的时候不要迟疑,立马换液处理。

     

    三、培养中的注意事项及传代步骤

    1、培养之前,一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行热源处理。(200-250℃烘烤4-6h)

    我们的消化及传代方法:

    方法一、消化液:0.5%胰酶、0.2EDTA,实验前加温到37℃以T25培养瓶为例:

    1、细胞贴壁生长,长满瓶底的95%时,弃去培养液,加D-HANKS漂洗两次; 

    2、加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,消化37℃约2-5min,镜下可看见细胞基本脱落即终止消化,收集消化后的细胞;(因为底层的细胞一般长有伪足,它紧紧的贴在瓶壁上,更难消化,消化时可先收集上层细胞,然后再消化底层细胞,每次消化下来的细胞不能放在同一瓶里)。

    3、加入D-HANKS漂洗两次,加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,37℃消化约2-5min,继续消化底层的细胞,镜下可看见细胞基本脱落即终止消化,单独收集消化后的细胞;

    4、加入新培养液10ML轻轻弹散混悬细胞,按需要分入新的培养瓶中,37℃CO2培养箱,几小时后即可贴壁。

     

    四、冻存的注意事项:

    1、RAW264.7的冻存过程应尽量减少热源对细胞的影响,这样对细胞种子的洁净度有更好的保障。

    2、这种细胞对空间状态很敏感,所以复苏的细胞密度或复苏细胞数量控制在10^4-10^5为宜,这种接种密度接种在75cm2培养瓶中养2天后细胞密度即可到达70-80%,若细胞在复苏的时候有伪足,先让细胞生长到堆叠起来,然后再进行传代,底部细胞弃掉,尽量选择好的血清培养,可让新生细胞慢慢达到未激活状态。

     

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