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    备择方案 2 示踪标记细胞

    发布时间: 2022-03-10  点击次数: 146次

    原理

    材料与仪器

    细胞悬液/贴壁细胞 [35S]标记L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]标记蛋白质水解产物
    PBS(冷冻) 37℃ 示踪培养基
    配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

    步骤

    1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min (见基本方案步骤 1~4,或见备择方案 1 步骤 1~5)。


    2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液,用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次,并加入 10 ml 37℃ 的示踪培养基。


    3. 37℃ 培养到预期时间。拧紧试管盖子在旋转情况下培养细胞悬液。在 032 培养箱里孵育贴壁细胞。


    4. 刮取贴壁细胞并转移到 15 ml 离心管。收集刮取的细胞或细胞悬浮液于 4℃ 300 g 离心 5 min。


    5. 可选:通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量(见辅助方案)。

    注意事项

    1. 将2倍体积含有过量未标记甲硫氨酸(15mg/L)的示踪培养基直接加入到标记混合物中,能够快速终止标记反应。

    2. 示踪≤2 h,细胞悬液的最终浓度应该是 2 × 106 细胞/ml,或示踪>2 h,用 0.5 × 106 细胞/ml。 对贴壁细胞而言,加 10 ml/100 mm 平皿。

    常见问题

    1. 上清可以弃掉,也可以收集起来用于分析分泌或脱落到培养基中的蛋白质。

    2. 如果细胞沉淀不马上使用的话,见基本方案步骤7。

    同实验其他方法

    氨基酸代谢标记实验

    1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~

    备择方案 1 对贴壁细胞

    1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1

    备择方案 3 长期细胞标记

    1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(见基本方案步骤 1)。2.1 对于悬浮细胞:用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次

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