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备择方案 2 示踪标记细胞
发布时间： 2022-03-10 点击次数： 575次原理
材料与仪器
细胞悬液／贴壁细胞 [35S]标记L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]标记蛋白质水解产物
PBS(冷冻) 37℃ 示踪培养基
配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器步骤
1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min （见基本方案步骤 1~4，或见备择方案 1 步骤 1~5）。
2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示踪培养基。
3. 37℃ 培养到预期时间。拧紧试管盖子在旋转情况下培养细胞悬液。在 032 培养箱里孵育贴壁细胞。
4. 刮取贴壁细胞并转移到 15 ml 离心管。收集刮取的细胞或细胞悬浮液于 4℃ 300 g 离心 5 min。
5. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。
注意事项
1. 将2倍体积含有过量未标记甲硫氨酸（15mg/L）的示踪培养基直接加入到标记混合物中，能够快速终止标记反应。
2. 示踪≤2 h，细胞悬液的最终浓度应该是 2 × 106 细胞/ml，或示踪>2 h，用 0.5 × 106 细胞/ml。 对贴壁细胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿。
常见问题
1. 上清可以弃掉，也可以收集起来用于分析分泌或脱落到培养基中的蛋白质。
2. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。
同实验其他方法
氨基酸代谢标记实验
1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 107~
备择方案 1 对贴壁细胞
1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 细胞，取决于细胞类型）。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1
备择方案 3 长期细胞标记
1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（见基本方案步骤 1）。2.1 对于悬浮细胞：用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次
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