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    备择方案 3 长期细胞标记

    发布时间: 2022-03-10  点击次数: 187次

    原理

    长期标记意味着对细胞进行 6~32 h 持续的代谢标记。该方法特别适用于研究合成速度相对较慢的蛋白质或研究成熟的标记蛋白而不是生物合成的前体。稳定状态的标记是长期标记的一种形式,在此过程细胞和放射性标记的氨基酸一起孵育直至放射性标记蛋白的合成和降解速率相当。如果蛋白质复合体中的亚基的初级结构已知,该方法可以对这些亚单位进行化学计量。所加入的未标记的甲硫氨酸量依赖于某些因素,如标记的时间和细胞浓度。通常使用的培养基中含有 5%~20% 正常的非标记甲硫氨酸含量。

    材料与仪器

    细胞悬液/贴壁细胞 [35S]标记L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]标记蛋白质水解产物
    PBS(冷冻) 37℃ 长期标记培养基
    75 cm2 组织培养瓶

    步骤

    1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(见基本方案步骤 1)。


    2.1 对于悬浮细胞:用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次(见基本方案步骤 2)。


    在 25 ml 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重悬 0.5 ×107~2 ×107 细胞,并转移到 75 cm2 组织培养瓶中。


    2.2 对贴壁细胞: 75 cm2 组织培养瓶中生长 0.5 ×107 ~2 ×107 的贴壁细胞(80% ~90%融合),在 CO2 培养箱中。用预热的长期标记培养基洗细胞一次(见备择方案 1 步骤 3)。每个 75 cm2 组织培养瓶中加入 25 ml 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液。


    3. 拧紧盖子以防 [35S] 标记的化合物挥发。在 CO2 培养箱内培养 16 h。


    4. 洗细胞并测定掺入量(见基本方案步骤 5~7;或备择方案 1 步骤 6~8)

    注意事项

    常见问题

    同实验其他方法

    氨基酸代谢标记实验

    1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~

    备择方案 1 对贴壁细胞

    1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1

    备择方案 2 示踪标记细胞

    1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记

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