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    部分分解多肽两端有关的 PCR 法筛选 PK-120 基因实验

    发布时间: 2022-03-24  点击次数: 124次

    材料与仪器


    PK-120
    Sephadex-50 Gene Amp RNA PCR 试剂盒 合成寡聚核苷酸 抽提液 酵母 tRNA
    PCR 扩增仪


    步骤


    实验所需「试剂」具体见「其他」


    1. 引物设计


    PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中,最长序列 K-15,16 为引物设计的依据:

    1.1 考虑全部编码的组合,

    1.2 考虑人编码的使用频率,设计 PCR 引物,正义链及反义链如用这些引物获得的 PCR 产物当中,50 bp 的产物为目的 cDNA。


    2. PCR 扩增


    从肝脏来源的 poly(A)+ RNA 中,用 Gene Amp RNA PCR 试剂盒如以下所述,合成 cDNA 0.1ug 的 poly(A)+ RNA 中,加入 5 mmol/L MgCl2:

    1×PCR 缓冲液Ⅱ,

    2 mmol/L dNTPs,

    1u 的 RNase inhibitor,

    2.5 umol/L random hexamers

    2.5 u 反转录酶,

    混匀,总体积为 20 ul。


    在 PCR 扩增仪上反应,PCR 参数为 :

    25℃ 10 min,

    42℃ 30 min,

    99℃ 5 min,

    25℃ 5 min ,

    第 1 循环反应,合成 cDNA。

    在反应液中再分别加终浓度为 2 mol/L MgCl2,1×PCR 缓冲液Ⅱ,加 1nmol 3' 引物 5' 引物。混合,总体积为 100 ul。

    94℃ 3 min 1 循环。

    94℃ 1 min,

    37℃~42℃,2 min,

    72℃, 2 min,

    40 循环。

    72℃, 7 min,1 循环。


    3. 凝胶电泳及提取 DNA


    纯化 PCR 产物后,在 0.25×TBE 溶液中,进行 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量标准使用限制性酶 Msp1 消化的质粒 pBR322。电泳结束后,凝胶经溴化乙锭染色,紫外照射,观察到 50 bp 的 PCR 产物。将这 50 bp 的条带切下,在抽提液中,室温放置过夜之后 1200 r/min 4℃ 离心 10 min,回收上清。反复操作两次,用乙醇沉淀 2 次,用 TE 液溶解,上样 Sephadex-50 柱,再用乙醇沉淀洗脱组分,沉淀悬浮于 TE 溶液中。


    4. 测定碱基序列


    抽取提出的 PCR 产物用 PCRⅡ载体亚克隆,测定碱基序列。其结果以肝脏 poly mRNA 为模板,据引物 S15-i 和 A15-i 扩增的 50 bp 的 PCR 产物序列,和从氨基酸序列预测的碱基序列完全一致。表明这是编码母的部分分解多肽的 cDNA。


    注意事项


    常见问题


    试剂:


    Sephadex-50


    Gene Amp RNA PCR 试剂盒


    合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS,INC 公司产品合成寡聚核苷酸


    抽提液


    750 mmol/L 醋酸铵-10 mmol/L 醋酸镁-0.1 mmol/L EDTA-0.1%SDS-1%TE 饱和酚


    25ug/ml 酵母 tRNA


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