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    正常大鼠原代主动脉平滑肌细胞培养方法

    发布时间: 2022-10-24  点击次数: 220次

    PriCells –正常大鼠原代主动脉平滑肌细胞培养

    一、实验试剂

    1、培养基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

    2、冻存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

    3、洗涤液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S

    4、染色液: 0.4% Trypan Blue

    5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit

    6、检测试剂:肌动蛋白、a-SMA或Desmin抗体,荧光标记二抗,4%多聚甲醛

    二、实验器械

    1、培养皿

    2、培养瓶

    3、直剪和眼科剪

    4、眼科镊和止血钳

    5、玻璃滴管

    6、烧杯

    7、15ml离心管

    三、实验流程

    成年大鼠,麻醉,无菌获取主动脉血管
    1 × PBS (pH 7.4 )洗涤血管,剥去血管外膜外附着的组织
    纵向剪开血管,内膜向上,用钝镊子横向刮动血管内膜,去掉内皮细胞,用1 × PBS (pH 7.4 )反复洗涤。
    用镊子横向刮动血管,刮下来中膜层,收集中膜用PBS洗涤,加入少量培养基(PriCells),将血管剪切为1×1mm3的小块,1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次
    组织块中加入消化液(PriCells),转至15ml离心管中于37℃水浴恒温消化15min,间隔2-3min摇动,静置1min,收集消化液,重复消化3-4次。
    收集消化液,加入消化终止液(PriCells)终止反应
    离心,1000rmp,10min,弃去上清
    重悬,计数细胞
    接种密度以5 × 105个/ml

    培养37℃,5%CO2

    四、实验操作
    1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶,置于超静台吹干或45℃烘箱烘干(切记保持无菌),4℃冰箱放置,备用。
    2、取材:正常成年大鼠腹腔注射5%苯巴(匕匕)妥麻醉,75%酒精浸泡,无菌条件下迅速取出大鼠主动脉。
    3、材料预处理:将获取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS (pH 7.4 )中反复洗涤,去除血管外部的血污渍,洗涤液澄清,用无菌镊子剥去外膜面的残留组织。PBS洗涤净。
    4、除去内皮细胞:将血管纵向剪开, 内膜面向上,无菌镊子沿中轴方向反复刮动内膜层4-5遍,去掉内皮细胞,用1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次。
    5、分离中膜:将去掉内膜的血管,继续刮动分离中膜,去掉外膜,用眼科剪将内膜剪碎为1×1mm3的小块,加入1 × PBS (pH 7.4 ),转移到15ml 离心管中,PBS洗涤3次,离心收集沉淀物。
    6、消化:在洗净的内膜碎块中加入消化酶液,将离心管放入37℃水浴消化15min。
    7、终止消化:吸出消化液入新的离心管中,按1:1加入消化终止液,中止酶反应;余下的组织继续加入消化液,消化15min ,重复消化3次。
    8、收集重悬细胞:收集中止后的消化液于离心管中,1000 rpm,离心10 min,弃去上清,加入培养液重悬,染色计数细胞。
    9、培养细胞密度:调整细胞密度以5 × 105个/ml 接种入培养瓶。
    10、培养:放置于37℃,5% CO2培养箱中。
    五、细胞鉴定
    1、显微鉴定:相差显微镜下,可见细胞呈长梭状,具备良好的透光性。细胞之间呈现典型的波峰波谷样生长,有接触抑制的特点。

    2、免疫组织化学鉴定 :利用肌动蛋白、a-SMA或Desmin免疫荧光染色鉴别平滑肌细胞。

    1) 细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中,接种细胞为3×104个/孔,48小时候细胞可以长满,用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。

    2) 细胞固定:用1 × PBS (pH 7.4 )洗涤细胞,之后放入4%多聚甲醛中,固定10min,空气中自然干燥。

    3) 特异性抗体:按照说明书稀释比要求稀释抗体,加入抗体,放置37℃孵育60min。

    4) 洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。

    5) 标记性抗体:加入荧光标记抗体,37℃孵育30min。

    6) 洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。

    7) 封片:封片剂封片。

    8) 镜检:荧光显微镜下观察,平滑肌细胞胞质呈现较强棕红色荧光。
    六、注意事项
    1、为了保持细胞活力,大鼠适宜采用药物麻醉后取材。大鼠应严格消毒,无菌解剖,打开胸腔后换取另一套器械获取主动脉血管。
    2、注意尽可能洗涤净血管内的残血,避免血细胞及某些血清成分对细胞贴壁的影响。
    3、血管由内膜层,中膜层和外膜层三层膜结构构成,而血管平滑肌细胞主要分布在血管中膜层,采用机械刮除法去掉内膜后再获取中膜以分离细胞,从血管内膜面刮下的细胞可以收集计数,培养主动脉血管内皮细胞。
    4、酶消化法分离血管平滑肌细胞,酶消化过度容易损伤细胞,影响平滑肌细胞的贴壁,因此消化过程中应针对所分离的细胞源组织的构成,选择适宜的酶,并严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
    5、严格控制细胞培养条件。包括细胞培养用液(培养基,生长因子,血清,抗生素)的质量,浓度。
    6、传代培养细胞接种量为5×104个(25 cm2培养瓶),细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为5-8代, 传代次数增加,细胞体积增大,细胞间易相互融合,界限不明朗,细胞贴壁牢固,传代消化时间会有所延长。


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