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    蛋白质分离实验

    发布时间: 2022-12-01  点击次数: 156次

    简介

    蛋白质分离的方法主要有 3 种:SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质、免疫沉淀法分离蛋白质和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质。

    原理

    SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的基本原理是蛋白质在 SDS 和巯基乙醇的作用下,分子中的二硫键还原,氢键打开,形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物,聚丙烯酰胺(PAGE)是一种具有三维结构的网状高分子聚合物,具有分子筛的作用。蛋白质在 PAGE 电泳中向正极迁移,迁移速率取决于分子的大小、电荷及其空间结构。SDS 带有较强的负电荷,不同的蛋白质与之结合后具有相同的荷质比,并具有相似的空间构象,使得 SDS-蛋白质复合物在 PAGE 中的迁移速率只与蛋白质的分子大小相关。
    免疫沉淀法分离蛋白质的基本原理是是利用特异的抗体从细胞裂解物中分离目的蛋白的一种沉淀方法。该方法首先要制备细胞裂解液,然后将特异性抗体加到细胞裂解液中,4 ℃ 下孵育一定时间后,再加入可以与特异性抗体结合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗体复合物而沉淀。将沉淀下来的抗原-抗体复合物在含有 SDS 和 DTT 的缓冲液中加热后,使被沉淀的抗原释放出来,经电泳分离后即可用各种方法检测。

    双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质是根据蛋白质的两个一级属性-等电点和分子质量的特异性,将蛋白质混合物在电荷(等电聚焦,IEF)和分子质量(变性聚丙烯酰胺凝胺电泳,SDS-PAGE)两个水平上进行分离。2D-PAGE 的第一向电泳是等电聚焦电泳(IEF),蛋白质因所带净电荷的不同而被分离开;然后对蛋白质进行第二向电泳-SDS-PAGE,在 SDS-PAGE 中,不同分子质量的蛋白质相互间分离开。由于蛋白质的分子质量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质,而 2D-PAGE 同时利用了蛋白质间在这两个性质上的差异分离蛋白质。



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