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    大鼠肝癌模型法

    发布时间: 2022-12-02  点击次数: 180次

    原理


    1. Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。在正常的体细胞中,β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。只有当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合激活胞内的d ishevelled(散乱的)蛋白导致GSK3B失活,使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命运 , β-catenin才能在胞质中积累起来。


    2. 当胞质中B-catenin的浓度达到一定水平时, 就可向细胞核转移。在胞核中β-caten in与转录因子家族Tcf /Lefs结合, 可激活cyc linD1 和cmyc等原癌基因而导致细胞的增殖、分化、成熟。显然, 在这条信号通路中β-catenin 发挥了重要作用,其在胞质中积累继而向胞核的转位, 被认为是该信号通路被激活的标志。已有研究证实,Wnt/β-catenin信号通路在人结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生中被激活。并抑制下游蛋白质复合物,包括axin、GSK-3、与APC蛋白。axin/GSK-3/APC 复合体可促进细胞内信号分子β-catenin的降解。当“β-catenin 降解复合物"被抑制后,胞浆内的β-catenin得以稳定存在,部分 β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。


    3. 建立大鼠的肝癌模型,以Wnt/β-catenin 信号通路中的几个关键因子为研究对象, 探讨它们在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和肿瘤肝脏中的表达,以期揭示Wnt/β-catenin信号转导通路与肝肿瘤发生的关系,为临床上肝癌的诊治提供新的线索。


    材料与仪器

    SD雄性大鼠
    兔抗β- caten in 抗APC 抗体 鼠抗cyclin D1 mAb PV6001两步法检测试剂盒 总RNA 提取试剂盒 PCR 反应试剂盒
    凝胶成像仪 电泳仪 PCR仪器 枪头 枪头盒 移液枪 超净台

    步骤

    1.  大鼠肝癌模型的建立


    将二已基亚硝胺( DENA)的水溶液以70 m g /kg的剂量每周灌胃1次, 15周停药。有10只大鼠在造模过程中死亡,其余32只分别在喂药后第1、4、6、8、10、12、14、16周,处死动物,每次处死4 只。每只取不同部位的小块肝组织,分别置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮冻存。正常对照组8只,不给药。


    2.  wnt1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及cmyc mRNA 的RT-PCR 检测


    引物的设计和合成交由大连宝信生物公司完成,经验证后使用。


    扩增wnt1 基因的引物序列为: 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3,扩增产物长度为432 bp,退火温度为58e 。扩增β-caten in基因的引物序列为: 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3,扩增产物长度为375 bp, 退火温度为58. 2e 。


    扩增APC 基因的引物序列为: 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3,扩增产物长度为310 bp,退火温度为60e 。


    扩增cy clin D1基因的引物序列为: 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3,扩增产物长度为440 bp, 退火温度为58e 。


    扩增cmyc基因的引物序列为: 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3,扩增产物长度为186 bp,退火温度为60. 5e 。


    扩增内参照B-actin引物的序列为5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3,扩增产物的长度为665 bp, 退火温度为60e 。


    注意事项


    1. 采用多聚甲醛来固定大鼠组织时,固定时间避免太久,否则组化尽出假阳性。把固定时间确定下来,固定好后放低浓度酒精里可以放置时间久一点。


    2.  对于取出大鼠小块肝部位,避免肝的重要部位有镊子的刮痕,以免对实验后期的观察产生影响。             

    3. 实验需要进行对照组对比,以免出现假阳性或假阴性结果。


    4. 扩增基因序列时,要严格按照所设定的温度进行。


    常见问题


    1. Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中,是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中,具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变,导致信号异常活化,就可能诱导癌症的发生。


    2. 经文献报道,研究人员检查了超过3500份的癌症样本,包括结肠癌、黑色素瘤、肝细胞瘤、脊髓母细胞瘤、消化道肿瘤等,发现在超过700个癌症病例中出现β-Catenin的多种突变。Β-Catenin的N端序列可能是其致癌的关键位点,这些位点的突变使得β-Catenin在胞内表达失控,导致Wnt信号异常激活,从而诱发包括结直肠癌、肝母细胞瘤、卵巢癌和前列腺癌等在内的多种癌症。


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