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    多潜能干细胞的诱导

    发布时间: 2022-12-02  点击次数: 246次

    简介

     

    多潜能干细胞(in-duced pluripotent stem cells,iPS)技术不仅可以解决胚胎干细胞来源引起的伦理问题,而且自体 iPS 细胞可以避免异体来源胚胎干细胞移植引起的免疫排斥反应。目前就成体细胞诱导产生 iPS 细胞相关的几种转录因子以及诱导方法、如何提高诱导产生 iPS 细胞的效率以及 iPS 细胞临床应用方面都是在 Yamanaka 报道的诱导方案基础上的改良。

     

    原理

     

    Yamanaka 法诱导多能干细胞的原理是把 Oct3/4,Sox2、c-Myc 和 Klf4 这四种转录因子基因克隆入病毒载体,然后引入小鼠成纤维细胞,发现可诱导其发生转化,产生的 iPS 细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

     

     

    材料与仪器

     

    器材:

    ① 37 ℃ 水浴锅

    ② 一次性无菌培养皿

    ③ 一次性无菌移液管

    ④ T75 培养瓶

    ⑤ 涂有明胶的 6 孔板

    ⑥ 15 ml 离心管、注射器和针头

    试剂:

     

    ① 材料:提前制备好的饲养层细胞

    ② DMEM 培养基

    ③ 胎牛血清

    ④ 谷酰胺

    ⑤ 非必需氨基酸

    ⑥ DF12 培养基

     

    ⑦ 血清替代物
    ⑧ 谷酰胺+2-巯基乙酉享溶液
    ⑨ b-FGF 溶液
    ⑩ β-巯基乙醇

     

    步骤

     

    多潜能干细胞的诱导的基本过程可分为如下几步:

    (一)试剂配制


    (1)MEF 培养基的配制 DMEM 培养基,450 ml;胎牛血清(56 ℃ 热灭活 30 min),50 ml;200 mmol/L-谷酰胺,5 ml;非必需氨基酸,5 ml。将所有组分混合后,用 0.22 μm 滤器过滤除菌,4 ℃ 保存,保持无菌。

    (2)胚胎干细胞培养基的配制 DF12 培养基,200 ml;血清替代物,50 ml;200 mmol/L-谷酰胺+2-巯基乙酉享溶液,1.25 ml;非必需氨基酸 100x 溶液,2.5 ml;b-FGF 溶液,5 ml。所有组分都加入 250 ml 培养瓶中,用 0.22 μm 滤器过滤除菌。培养基最好在 2 周内使用。

     

    (3)200 mmol/L-谷酰胺+2-巯基乙酉享溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺(使用前冷冻保存),5 ml;β-巯基乙醇,7 μl。混匀。

    (4)b-FGF 的配制。b-FGF,10 μg;0.1% BSA 无菌,5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分装,冷冻保存。

    (二)开始前准备


    (1)小鼠胚胎成纤维细胞的获得 通过同源重的方法将双选择标记系统,如βgeo(neo 用于 G418 筛选,βGal 用于显影)基因盒,同源重组到小鼠 Nanog 基因位点,使βgeo 受内源性 Nanog/O)ct 启动子控制,由于 Nanog 只在 ESC 中表达,所以来源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的体细胞由于缺乏 ES 特性,不能在 G418 中生长。按 MEF 制备方法,从 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分离培养 Fbx15βgea/βgeo 来源的 MEF。

    (2)经典的「Yamanaka」法 OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC 病毒的准备。

    (3)MEF 饲养层细胞的制备。

    (三)细胞诱导


    (1)感染前一天,将处于对数生长期的 Fbx15 Pgco/βgeo 来源的 MEF 细胞铺于 6 孔培养板,使感染时细胞达到 80% 的汇合。

    (2)按测定的病毒滴度,以 10 个 pfμ/细胞加入适量浓缩病毒上清,用 MEF 培养基补齐至每个孔 2.5 ml 体积,再加入终浓度为 8 μg/ml 的 polybrene(聚凝胺),混合均匀。

    (3)弃去 Fbx15 βgeo/βgco 来源的 MEF 细胞的培养上清液,加入上步制备的病毒溶液,6 孔培养板每孔加 2.5 ml 的病毒溶液。37 ℃ 孵育 4 h 到过夜。

     

    (4)换新鲜胚胎干细胞培养基。

    (5)感染后 3 d,向培养基中添加终浓度为 0.3 mg/ml 的 G418。

    (6)每 2~3 天换新鲜胚胎干细胞培养基,添加终浓度为 0.3 mg/ml 的 G418,进行克隆筛选,持续 2~3 周。

    (7)在培养过程中,观察克隆形成情况。将其中与 ES 细胞形状相似克隆按 ESC 培养方法扩增传代,并进行鉴定。

    (四)实验结果及分析


    诱导成功的 iPS 需进行多能性的鉴定,鉴定的内容包括以下几方面。

    (1)形态学标准。

    (2)生长特性。

     

    (3)发育潜能:2N 囊胚注射,获得嵌合体病能通过生殖系遗传给后代(形成三胚层细胞并能够形成配子细胞遗传给下一代);4N 囊胚注射,通过此方法获得的小鼠,胚外组织来源于 4N 的细胞,而小鼠则全部来自 iPS 细胞。

    (4)标志分子表达。

    (5)表观遗传学特性。

     

     

    注意事项

     

    (1)目前已经报道的转录因子的组合有很多,在 Yamanaka 四因子基础上,还报道的组合有 OCT4,SOX2,NANOG 和 LIN28;OCT4,SOX2 和 KLF4;Sox2,c-Myc 和 Klf4;使用前冷冻保存。按 50 ml 分装后冷冻保存,使用前融化。
    (2)目前用于过表达上述核心转录因子的手段有很多,包括反转录病毒载体,腺病毒载体,转染质粒,重组蛋白诱导方法,化学小分子 [例如 G9a 组蛋白甲基转移酶的小分子抑制剂 BIX-01294(BIX)] 等。
    (3)对于提高诱导效率方面,MSC 作为诱导细胞其诱导成为 iPS 的效率较皮肤来源成纤维细胞的比率高:组蛋白脱乙酰基酶抑制剂内戊酸(VPA)和新报道的维生素- C 能显著提高 iPS 的诱导比率。
    (4)阳性克隆的筛选方法包括报告基因筛选和形态学标准筛选。报告基因筛选方法是指用基因重组技术建立具有药物抗性基因的小鼠成纤维细胞抗性受内源性 nanog 或()ct4 表达调控,通过压力筛选,表达耐药基因的克隆优势生长。

     

     

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